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抗CD52抗體.pdf

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CD52 抗體
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摘要
申請專利號:

CN201480028098.X

申請日:

2014.03.13

公開號:

CN105209495A

公開日:

2015.12.30

當前法律狀態:

實審

有效性:

審中

法律詳情: 實質審查的生效IPC(主分類):C07K 16/28申請日:20140313|||公開
IPC分類號: C07K16/28; C12N15/13; C12N15/63; C12N5/10; A61K39/395 主分類號: C07K16/28
申請人: 建新公司
發明人: H·邱; R·R·魏; C·Q·潘; R·森達克
地址: 美國馬薩諸塞州
優先權: 2013.03.15 US 61/794,576
專利代理機構: 北京市嘉元知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11484 代理人: 張永新
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201480028098.X

授權公告號:

|||

法律狀態公告日:

2016.03.23|||2015.12.30

法律狀態類型:

實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供抗人CD52抗體及其抗原結合片段。還提供用于制備所述抗體和片段的分離核酸、重組載體和宿主細胞。所述抗體和片段可用于治療應用,以治療例如自身免疫疾病、癌癥和移植排斥。

權利要求書

1.  一種抗人CD52的抗體或其抗原結合片段,其包含重鏈可變區和輕鏈可變區,
其中所述重鏈可變區包含:
(a)SEQIDNO:7的重鏈CDR1;
(b)SEQIDNO:8的重鏈CDR2;和
(c)SEQIDNO:9的重鏈CDR3;
其中所述輕鏈可變區包含:
(a)SEQIDNO:86的重鏈CDR1;
(b)SEQIDNO:34的重鏈CDR2;和
(c)SEQIDNO:35的重鏈CDR3。

2.
  根據權利要求1的抗體或片段,其中所述抗體或片段相對于包含無信號序列的SEQIDNO:3重鏈氨基酸序列和無信號序列的SEQIDNO:4輕鏈氨基酸序列的抗體顯示增加的穩定性。

3.
  根據權利要求1的抗體或片段,其中SEQIDNO:86的殘基11是K、R、Q、H、S、Y、A、D、E、F、I、L、M、N、T或V(SEQIDNO:136)。

4.
  根據權利要求1的抗體或片段,其中SEQIDNO:86的殘基11是K(SEQIDNO:24)。

5.
  根據權利要求1的抗體或片段,其中SEQIDNO:86的殘基11是R(SEQIDNO:29)。

6.
  根據權利要求1的抗體或片段,其中SEQIDNO:86的殘基11是Q(SEQIDNO:28)。

7.
  根據權利要求1-6任一項的抗體或片段,其中所述重鏈可變區包含SEQIDNO:59。

8.
  根據權利要求1-6任一項的抗體或片段,其中所述輕鏈可變區包含選自SEQIDNO:68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82和83的序列。

9.
  根據權利要求1-6任一項的抗體或片段,其中所述重鏈和輕鏈可變區分別包含:
a)SEQIDNO:59和68;
b)SEQIDNO:59和69;
c)SEQIDNO:59和70;
d)SEQIDNO:59和71;
e)SEQIDNO:59和72;
f)SEQIDNO:59和73;
g)SEQIDNO:59和74;
h)SEQIDNO:59和75;
i)SEQIDNO:59和76;
j)SEQIDNO:59和77;
k)SEQIDNO:59和78;
l)SEQIDNO:59和79;
m)SEQIDNO:59和80;
n)SEQIDNO:59和81;
o)SEQIDNO:59和82;或
p)SEQIDNO:59和83。

10.
  根據權利要求1-6任一項的抗體或片段,其包含無信號序列的SEQIDNO:3重鏈。

11.
  根據權利要求1-6任一項的抗體或片段,其包含選自SEQIDNO:43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57和58的輕鏈。

12.
  一種抗體,其包含:
(a)無信號序列的SEQIDNO:3重鏈氨基酸序列,和SEQIDNO:49的輕鏈氨基酸序列,
(b)無信號序列的SEQIDNO:3重鏈氨基酸序列,和SEQIDNO:53的輕鏈氨基酸序列,或
(c)無信號序列的SEQIDNO:3重鏈氨基酸序列,和SEQIDNO:54的輕鏈氨基酸序列。

13.
  根據權利要求1-9任一項的抗體,其為免疫球蛋白G(IgG)。

14.
  根據權利要求1-11任一項的片段,其中所述片段選自scFv片段、Fab片段、Fv片段、F(ab')2片段、微型抗體、雙抗體、三抗體和四抗體。

15.
  根據權利要求1-9任一項的抗體或片段,其中所述抗體包含人Fc區。

16.
  根據權利要求15的抗體或片段,其中所述人Fc區是人IgG1、IgG2、 IgG3或IgG4Fc區。

17.
  根據權利要求15的抗體或片段,其中所述人Fc區是人IgG1Fc區。

18.
  根據權利要求15的抗體或片段,其中所述人Fc區是人IgG2Fc區。

19.
  根據權利要求15的抗體或片段,其中所述人Fc區是人IgG3Fc區。

20.
  根據權利要求15的抗體或片段,其中所述人Fc區是人IgG4Fc區。

21.
  根據權利要求1-20任一項的抗體或片段,其中所述抗體是單克隆抗體。

22.
  根據權利要求1-21任一項的抗體或片段,其中所述抗體是人源化抗體。

23.
  根據權利要求1-22任一項的抗體或片段,其中重鏈C端的賴氨酸是可裂解的。

24.
  一種分離的核酸分子,其包含編碼根據權利要求1-23任一項的抗體或片段的重鏈或其抗原結合片段,或輕鏈或其抗原結合片段,或兩者的核苷酸序列。

25.
  根據權利要求24的分離核酸分子,其包含SEQIDNO:95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134的核苷酸序列。

26.
  一種重組載體,其包含權利要求24的核酸分子。

27.
  根據權利要求26的載體,其中所述載體是表達載體。

28.
  一種分離的宿主細胞,其包含根據權利要求26或27的載體。

29.
  一種分離的細胞系,其產生根據權利要求1-23任一項的抗體或片段或抗體或片段的重鏈或輕鏈。

30.
  一種制備抗人CD52抗體或其抗原結合片段的方法,其包括(1)在適于表達抗體或片段的條件下,保持包含根據權利要求1-23任一項編碼所述重鏈或其抗原結合片段的核苷酸序列和編碼所述輕鏈或其抗原結合片段的核苷酸序列的細胞;和(2)回收所述抗體或片段。

31.
  一種組合物,其包含根據權利要求1-23任一項的抗體或抗原結合片段和藥物上可接受的媒劑或載劑。

32.
  一種用于治療對其有需要的患者的方法,其包括向所述患者施用有效量的根據權利要求1-23任一項的抗體或抗原結合片段。

33.
  一種用于治療對其有需要的患者中自身免疫疾病的方法,其包括向所述患者施用根據權利要求1-23任一項的抗體或抗原結合片段。

34.
  根據權利要求33的方法,其中所述自身免疫疾病是多發性硬化癥。

35.
  一種用于治療對其有需要的患者中癌癥的方法,其包括向所述患者施用根據權利要求1-23任一項的抗體或抗原結合片段。

36.
  根據權利要求35的方法,其中所述癌癥是慢性淋巴性白血病。

37.
  一種抑制對其有需要的患者中血管生成的方法,所述方法包括向所述患者施用根據權利要求1-23任一項的抗體或抗原結合片段。

38.
  根據權利要求1-23任一項的抗體或抗原結合片段制備用于治療所需患者中的自身免疫疾病的藥物的用途。

39.
  根據權利要求38的用途,其中所述自身免疫疾病是多發性硬化癥。

40.
  根據權利要求1-23任一項的抗體或抗原結合片段制備用于治療所需患者中的癌癥的藥物的用途。

41.
  根據權利要求40的用途,其中所述癌癥是慢性淋巴性白血病。

42.
  根據權利要求1-23任一項的抗體或抗原結合片段制備用于抑制所需患者中的血管生成的藥物的用途。

說明書

抗CD52抗體
序列表
本申請包含作為ASCII形式的文本文件以電子方式已經提交的序列表,且其在此處以其全文通過提述并入。2014年3月11日生成的所述文件名稱為001662-0041-WO1_SL.txt且大小為142,582字節。
發明領域
本發明一般地涉及抗體,且更具體地涉及對于人CD52具有結合特異性的抗體。
相關申請的交叉引用
本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時申請61/794,576的優先權。該臨時申請的公開內容在本文以其全文通過提述并入。
發明背景
CD52是在多種正常和惡性類淋巴細胞(例如,T細胞和B細胞)上大量發現的(500,000分子/細胞)糖基化的、糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定的細胞表面蛋白。參見,例如,Hale等,JBiolRegulHomeostAgents15:386-391(2001);Huh等,Blood92:Abstract4199(1998);Elsner等,Blood88:4684-4693(1996);Gilleece等,Blood82:807-812(1993);Rodig等,ClinCancerRes12:7174-7179(2006);Ginaldi等,LeukRes22:185-191(1998)。CD52在例如單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞等髓樣細胞上以較低水平表達,其中在成熟自然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和造血干細胞上發現幾乎不表達(同上)。總之,CD52存在于至少95%的所有人外周血淋巴細胞和單核細胞/巨噬細胞中(HaleG,等,“TheCAMPATH-1antigen(CD52),”TissueAntigens,35:178-327(1990))。CD52還由副睪和輸精管中的上皮細胞產生,且在通過生殖道期間由精子獲得(Hale等,2001,見上文;Domagala等,MedSciMonit7:325-331(2001))。CD52的確切生物功能仍不清楚,但若干證據暗示其可能涉及T細胞遷移及共刺激 (Rowan等,IntImmunol7:69-77(1995);Masuyama等,JExpMed189:979-989(1999);Watanabe等,ClinImmunol120:247-259(2006))。
已開發數種抗CD52單克隆抗體。(還稱為阿侖單抗(alemtuzumab)、)是人源化抗人CD52單克隆抗體,其展現強效的體外細胞毒性效應(抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和補體依賴性細胞毒性(CDC))。阿侖單抗識別由成熟CD52蛋白羧基端四個氨基酸和帶負電荷的GPI錨定部分構成的表位。其他抗人CD52單克隆抗體也已產生。然而,在保存中和特定pH和溫度條件下,若干這些抗體的結合親和力降低。因此,對于具有降低的經歷該變化的傾向的抗CD52抗體存在需求。
發明概述
本發明的特征為經過工程化從而隨著時間經過并且在高pH和溫度條件下仍保持結合親和力的抗人CD52抗體。本文中的“抗體”和“免疫球蛋白”可互換使用。還提供包含編碼抗CD52抗體輕鏈或重鏈的序列的分離核酸、重組載體和宿主細胞,和制備抗CD52抗體的方法。
Ab26是具有SEQIDNO:3減去信號序列的重鏈氨基酸序列和SEQIDNO:4減去信號序列的輕鏈氨基酸序列的人源化抗人CD52單克隆抗體。Ab26在保存期間CD52的結合親和力和效力會隨時間降低。我們意外發現在輕鏈CDR1位置11具有某些單一氨基酸取代的Ab26變體(例如,單克隆抗體Ab21、Ab16和Ab20),相比Ab26,其不僅保留或超越Ab26的人CD52結合親和力,還展示顯著改善的穩定性。所述變體抗體如Ab21、Ab16和Ab20相比Ab26已展示體外及體內可比較或改善的生物學效力。這些變體可用于治療及診斷應用。
在一些實施方案中,本發明的抗人CD52抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區,其中所述重鏈可變區包含:SEQIDNO:7的重鏈CDR1、SEQIDNO:8的重鏈CDR2;和SEQIDNO:9的重鏈CDR3,且其中所述輕鏈可變區包含:SEQIDNO:86的輕鏈CDR1;SEQIDNO:34的輕鏈CDR2;和SEQIDNO:35的輕鏈CDR3。在進一步的實施方案中,SEQIDNO:86的殘基11可為K、R、Q、H、S、Y、A、D、E、F、I、L、M、N、T或V。在一個實施方案中,SEQIDNO:86的殘基11是K。在另一實施方 案中,SEQIDNO:86的殘基11是R。在另一實施方案中,SEQIDNO:86的殘基11是Q。
在一些實施方案中,抗CD52抗體或片段的重鏈可變區包含SEQIDNO:59。在另外的實施方案中,抗CD52抗體或片段的輕鏈可變區包含選自SEQIDNO:68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82和83的序列。舉例來說,本發明抗體或片段的重鏈和輕鏈分別可包含:a)SEQIDNO:59和68;b)SEQIDNO:59和69;c)SEQIDNO:59和70;d)SEQIDNO:59和71;e)SEQIDNO:59和72;f)SEQIDNO:59和73;g)SEQIDNO:59和74;h)SEQIDNO:59和75;i)SEQIDNO:59和76;j)SEQIDNO:59和77;k)SEQIDNO:59和78;l)SEQIDNO:59和79;m)SEQIDNO:59和80;n)SEQIDNO:59和81;o)SEQIDNO:59和82;或p)SEQIDNO:59和83。
在一些實施方案中,抗體或片段包含無信號序列的SEQIDNO:3重鏈氨基酸序列。在另外的實施方案中,抗體或片段包含選自SEQIDNO:43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57和58的輕鏈氨基酸序列。舉例來說,抗體或片段可包含(a)無信號序列的SEQIDNO:3的重鏈氨基酸序列和SEQIDNO:49的輕鏈氨基酸序列;(b)無信號序列的SEQIDNO:3的重鏈氨基酸序列和SEQIDNO:53的輕鏈氨基酸序列;或(c)無信號序列的SEQIDNO:3的重鏈氨基酸序列和SEQIDNO:54的輕鏈氨基酸序列。
在一些實施方案中,本發明抗體為免疫球蛋白G(IgG)。在另外的實施方案中,抗體包含人Fc區(例如,人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區)。本發明還涵蓋本發明任何抗體的抗原結合片段,其中所述片段選自scFv片段、Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、微型抗體、雙抗體(diabody)、三抗體(triabody)和四抗體(tetrabody)。
在一些實施方案中,本發明抗體是單克隆抗體。在進一步的實施方案中,抗體和抗原結合片段是人源化的。本發明抗體或片段的重鏈C端的賴氨酸可任選地裂解。
本發明還涉及包含編碼抗體的重鏈或其抗原結合片段或輕鏈或其抗原結合片段或兩者的核苷酸序列的分離核酸分子。在一些實施方案中,分離的核酸分子包含SEQIDNO:95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133或134的核苷酸序列。本發明還涵蓋包含該核酸分子的重組載體(例如,表達載體)。在一些實施方案中,本發明涵蓋包含該載體的分離的宿主細胞。
本發明還涵蓋產生本文描述的抗CD52抗體或片段或該抗體或片段的重鏈或輕鏈的分離細胞系。在一些實施方案中,本發明涉及制備抗人CD52抗體或其抗原結合片段的方法,其包括(1)在適于該抗體或片段表達的條件下保持本文所述的宿主細胞或細胞系;和(2)回收所述抗體或片段。
本發明涵蓋包含本文所述的抗體或抗原結合片段和藥物上可接受的媒劑(vehicle)或載劑(carrier)的組合物。
本發明涉及用于治療對其有需要的患者的方法,其包括對所述患者施用有效量的本文所述的抗體或抗原結合片段。在一些實施方案中,本發明涵蓋用于治療對其有需要的患者中的自身免疫疾病(例如,多發性硬化癥)的方法,其包括對該患者施用本文所述的抗體或抗原結合片段。在一些實施方案中,本發明涵蓋用于治療對其有需要患者中的癌癥(例如,慢性淋巴性白血病)的方法,其包括對該患者施用本文所述的抗體或抗原結合片段。本發明還涉及抑制對其有需要患者中的血管生成的方法,其包括對該患者施用本文所述的抗體或抗原結合片段。
在一些實施方案中,本發明涉及使用本文所述的抗體或抗原結合片段治療對其有需要患者中的自身免疫疾病(例如,多發性硬化癥),或制備其治療藥物的用途。本發明還涉及使用本文所述的抗體或抗原結合片段治療對其有需要患者中的癌癥(例如,慢性淋巴性白血病),或制備其治療藥物的用途。本發明進一步涉及使用本文所述的抗體或抗原結合片段治療對有需要患者中的過度血管生成,或制備用于抑制血管生成的藥物的用途。
附圖簡述
本專利或申請文件含有至少一個彩色繪圖。在請求和支付必要費用時,有關部門將提供具彩色繪圖的本專利或專利申請公開的副本。
圖1描繪抗CD52抗體的快速親和力篩選結果。上圖為制備抗體的流程圖。中圖和下方表格顯示BIACORETM結合分析和Octet表達水平測定的結果。
圖2描述表征純化的抗CD52抗體的實驗結果。上圖是顯示抗CD52抗體重鏈和輕鏈分離的SDS-PAGE凝膠的照片。分子量標記示于標記的泳道 (M)。下方的圖和表顯示BIACORETM結合分析的結果。
圖3描述顯示于CHO細胞中產生的Ab24和Ab10抗體制劑的SDS-PAGE凝膠照片。所述凝膠還顯示對照的抗CD52(CTL)抗體和Ab1抗體。箭頭指出100kD物種及LC剪切。
圖4描述SDS-PAGE凝膠照片,其顯示Ab24和Ab10抗體中存在的100kD類型(species),其中在右側顯示了“僅重鏈”的二聚體。還顯示N端測序結果。
圖5描述表征另外的抗CD52抗體的實驗結果。表和圖顯示BIACORETM結合分析及Octet表達水平測定的結果。“KGN”指具有SEQIDNO:3重鏈序列和SEQIDNO:2輕鏈序列的抗CD52抗體。
圖6描述表征純化抗CD52抗體的CD52結合的實驗結果。左圖為顯示野生型(CTL)和其他抗體的重鏈和輕鏈的SDS-PAGE凝膠照片。分子量標記示于標示的泳道(M)。右側曲線圖顯示BIACORETM結合分析的結果。
圖7為描述對照抗CD52抗體和抗體Ab21、Ab16和Ab20的CDC分析結果圖。
圖8描述在人CD52轉基因小鼠中,對照抗CD52(CTL)抗體和抗體Ab21、Ab16和Ab20的CD52+細胞消耗活性分析結果。左圖顯示血液樣品的結果。右側曲線圖顯示脾臟樣品的結果。
圖9顯示野生型人CD52蛋白的氨基酸序列(基因庫(Genbank)登錄編號AAH00644.1)(SEQIDNO:1))。
圖10顯示抗體Ab26、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25和KGN(SEQIDNO:3)的全長重鏈氨基酸序列,和抗體Ab26(SEQIDNO:4)的全長輕鏈氨基酸序列。粗斜體為信號序列,下劃線為CDR。
圖11顯示抗體Ab26、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25和KGN(SEQIDNO:5)的全長重鏈核酸序列,以及抗體Ab26、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25和KGN的全長輕鏈核酸序列。下劃線為信號序列,粗體為開放 閱讀框。
圖12顯示抗體Ab26、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24和Ab25的H-CDR1(SEQIDNO:7)、H-CDR2(SEQIDNO:8)、H-CDR3(SEQIDNO:9)、L-CDR2(SEQIDNO:34)和L-CDR3(SEQIDNO:35)的氨基酸序列。
圖13顯示抗體Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25和Ab26的L-CDR1的氨基酸序列。
圖14顯示抗體Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24和Ab25的全長輕鏈氨基酸序列。下劃線為CDR。
圖15顯示抗體Ab26、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24和Ab25的重鏈和輕鏈可變結構域的氨基酸序列。下劃線為CDR。
圖16顯示抗體Ab26、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25和KGN的重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域的核酸序列。
圖17描述表征從HEK293細胞純化的Ab1抗體的實驗結果。圖和表顯示BIACORETM分析測定Ab1和兩種Ab26制劑(CTL1和CTL2)對CD52肽的親和力結果。上右圖是顯示兩種Ab26制劑(CTL1和CTL2)和Ab1抗體的重鏈(HC)和輕鏈(LC)的還原性SDS-PAGE凝膠照片。
圖18描述表征從CHO細胞純化的Ab1抗體的實驗結果。圖顯示BIACORETM分析測定Ab1抗體(下圖)和Ab26抗體(CTL)(上圖)對CD52肽的親和力結果。
圖19為描述Ab1抗體和Ab26抗體(對照)的CDC分析結果的圖。結果以相對熒光單位(RFU)作為抗體最終濃度(單位為毫克/毫升)函數表示。
圖20描述抗CD52抗體的穩定性篩選結果。上左圖顯示在45℃和pH7.2就Ab26(CTL)和變體抗體而言,KD(nM)作為時間(周)的函數。上右圖顯示45℃ 和pH7.2就Ab26(CTL)及變體抗體而言,相對于T0的親和力作為時間(周)的函數。
圖21描述測試在三組分緩沖液中的溫育對抗CD52抗體穩定性的影響的實驗結果。上左圖顯示兩種Ab26制劑(CTL1和CTL2)和變體抗體在37℃和pH7.5于第0周、第2周和第4周的KD(nM)。上右圖顯示Ab26(CTL)和變體抗體在45℃和pH7.4于第0周、第2周和第4周的KD(nM)。
圖22描述Ab26(CTL)、Ab21、Ab16和Ab20在45℃溫育后尺寸排阻層析(SEC)-HPLC分析的結果。
發明詳述
本發明基于我們發現特定抗CD52抗體在特定pH和溫度條件下或在保存期間隨時間喪失穩定性并展示降低的結合親和力。我們已生成在親源抗體的輕鏈CDR1(L-CDR1)單一位置(位置11)包含氨基酸取代的變體抗體。我們已發現一些這樣的變體抗體相比親源抗體不僅展示相似或改善的抗原結合特性和生物活性(包括體內效價),還展示增強的穩定性。
本發明包含抗人CD52抗體、所述抗體的抗原結合片段(即部分)、所述抗體的輕鏈、所述抗體的重鏈和這些輕鏈或重鏈的片段。本發明涉及成熟抗體及其鏈(例如,糖基化抗體),以及未成熟或前體抗體蛋白。本發明還涉及編碼這些未成熟或成熟蛋白兩者的核酸分子(例如,載體),包含此類核酸的宿主細胞,生產未成熟和成熟蛋白的方法,及使用該抗體的方法。
本發明的抗體和抗原結合部分可用于治療對其有需要的受試者(例如,人患者)的各種由具有CD52的細胞介導或引起的疾病和癥狀,例如一些免疫介導的疾病(IMD)征兆。作用機制可能為抗CD52抗體通過引起細胞死亡而消耗這些細胞(例如,淋巴細胞或癌性CD52+細胞)。舉例來說,所述抗體可經由淋巴細胞消耗(一種經由減小循環性淋巴細胞群(例如,T細胞和/或B細胞)導致淋巴細胞減少獲得的免疫抑制類型)以治療自身免疫疾病(例如,多發性硬化癥(MS)、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、血管炎、肌炎和韋格納氏疾病(Wegener’sdisease))。本發明抗體還可用于治療癌癥,例如,白血病(例如,慢性淋巴性白血病)和淋巴瘤(例如,非霍奇金氏淋巴瘤);或用于組織移植(例如,實質器官移植(例如,腎移植)和干細胞移植)。本發明抗體還可用于富集造血干細胞,例如,在離體應用中(參見,例如,Lim等,J.Hematology&Oncology 1:19(2008))。
本發明抗體的抗原結合性質
本發明抗體對于人CD52或其部分具有結合特異性(例如,表位特異性),或選擇性結合于人CD52或其部分。這些抗體特異性地與CD52分子結合,且不會特異地與非CD52分子結合。舉例來說,抗CD52抗體和CD52間的特異性結合,可利用流式細胞測量法通過測量該抗體與CD52+細胞結合的EC50確定。特異性結合可以通過小于10微克/毫升的EC50表明(例如,利用流式細胞測量法測定)。本文所述的抗體可對人CD52或其片段具有結合特異性。結合分析可使用分離或重組人CD52、衍生自人CD52的肽或表達人CD52的細胞(例如,人T和/或B細胞、表達編碼人CD52或這些細胞的細胞膜組分的核酸的重組宿主細胞)進行。此外,所述抗體可對一種或多種人CD52形式(例如,糖基化人CD52、去糖基化人CD52、非糖基化人CD52和等位基因變體)具有結合特異性。在一個實施方案中,所述抗體對天然存在、內源性或野生型人CD52具有結合特異性。野生型人CD52的氨基酸序列示于圖9(SEQIDNO:1)中。
“抗原結合親和力”為本領域的術語,其描述結合相互作用的強度,一般指抗體對其抗原的整體結合強度。在一些實施方案中,本發明抗體與人CD52結合的親和力,以例如(1)1x10-7M或更小的KD(KD=Koff(kd)/Kon(ka))表示;優選為1x10-8M或更小;更優選為1x10-9M或更小;有利地為1x10-10M或更小;且最優選為1x10-11M或1x10-12。例如,該KD的范圍為100nM至1pM(即1x10-7至1x10-12M)、50nM至1pM、5nM至1pM或1nM至1pM。預期的抗原結合親和力還可如利用表面等離子共振測定,通過5x10-1s-1或更小的Koff速率常數表明;優選為1x10-2s-1或更小;有利地為1x10-3s-1或更小;更優選為1x104s-1或更小;又更優選為1x10-5s-1或更小;且最優選為1x10-6s-1或更小。舉例來說,該Koff速率常數的范圍可為5x10-1s-1至1x10-7s-1、1x10-2s-1至1x10-6s-1或5x10-3s-1至1x10-5s-1。在特定分析或設定中,期望的抗原結合強度還可以不超過10微克/毫升的EC50(例如,0.1-10微克/毫升的EC50)表示。
本發明抗體包括與CD52上的表位結合的抗體,所述表位與抗體Ab26或本文例示的任何其變體結合的CD52表位相同或重疊。表位結合可使用例 如競爭性結合分析的各種技術很容易地確定。本文所用的“表位”包括能特異性與抗體結合的任何蛋白質決定區(epitopedeterminant)。表位決定區通常由具化學活性的表面分子群(例如,氨基酸和/或碳水化合物或糖側鏈)組成,且通常具有特定的立體結構特征,以及特定的電荷特征。表位可為“線性”或“構象性”的。在線性表位中,蛋白質和相互作用分子(例如,抗體)間的所有相互作用位點沿著該蛋白的一級氨基酸序列呈線性存在。在構象表位中,相互作用的位點存在于蛋白上的、在一級多肽序列中彼此分開的氨基酸殘基之間。
在一個實施方案中,為確定測試抗體是否結合于本發明特定抗CD52抗體的相同或重疊的表位,可在飽和條件下使本發明的抗CD52抗體與CD52結合,隨后測定測試抗體與CD52的結合能力。如果測試抗體能與參照抗CD52抗體同時與CD52結合,則可推論該測試抗體與參照抗CD52抗體結合于不同的表位。然而,如果該測試抗體不能同時與CD52結合,則可推論該測試抗體結合的表位與參照抗CD52抗體所結合的表位相同或部分重疊,或該測試抗體結合的表位與參照抗體所結合的表位緊鄰。此實驗可使用ELISA、RIA、BIACORETM或流式細胞測量法進行。為測試抗CD52抗體是否和另一抗CD52抗體交叉競爭,可從兩個方向使用上述競爭方法,即確定參照抗體是否阻斷該測試抗體,反之亦然。
表位分級(binning)也可用于表征本發明的抗體。術語“分級”指根據其抗原結合特征對抗體分組的方法。根據其交叉競爭用于“分級”抗體的高通量方法描述于國際專利申請公開No.WO03/48731。“表位分級”可通過使未標記的抗CD52抗體形式“A”和對應于CD52序列的合成肽或CD52陽性細胞結合進行研究。接下來添加已標記的第二抗CD52抗體“B”,隨后評估相對于對照樣品(其中細胞或合成肽未預先暴露于抗CD52抗體“A”)的可結合的標記抗體量。可替換地,抗CD52抗體“A”和“B”可使用不同熒光團或可檢測的化學物質標記,隨后使用能檢測所述標記的裝置測量可同時吸引(engage)CD52抗原的兩種標記抗體量,或利用流式細胞測量術測量同時吸引CD52+細胞的兩種抗體的量。BIACORETM和Octet技術使研究未標記的抗體形式的競爭性結合成為可能。由于一些抗體的化學修飾可能損害結合活性,因此未標識抗體形式的這種使用符合所需。還參見描述于Jia等,J.Immunol.Methods288:91-98(2004)中用于進行表位分級的技術。
在一些實施方案中,本發明抗體以類似或優于抗體Ab26的親和力結合人CD52。在特定的實施方案中,本發明抗體具有和抗體Ab26相同或類似的表位特異性和生物功能(例如,消耗淋巴細胞功能)。在一個實施方案中,本發明抗體結合與包含人CD52的QTSS氨基酸殘基的表位結合。
本發明抗體和抗原結合片段的結構
天然存在的抗體具有共同的核心結構,其中兩個相同的輕鏈(約24kD)和兩個相同的重鏈(約55或70kD)形成四聚體。各鏈的氨基末端部分稱為可變(V)區,且可與各鏈剩余部分的更保守的恒定(C)區區分。輕鏈的可變區(還稱VL結構域)中為稱為J區的C端部分。重鏈的可變區(還稱VH結構域)中,除J區外還有D區。抗體中大部分的氨基酸序列變化局限于直接參與抗原結合的稱為高變區或互補決定區(CDR)的V區中三個分開位置。從氨基末端開始,這些區域分別稱為CDR1、CDR2和CDR3。所述CDR由更保守的框架區(FR)固定于適當位置。從氨基末端開始,這些區域分別稱為FR1、FR2、FR3和FR4。CDR區和FR區的位置和編號系統已由Kabat等人定義;參見,Kabat,E.A.,等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,U.S.GovernmentPrintingOffice(1991);Chothia&Lesk,CanonicalStructuresfortheHypervariableRegionsofImmunoglobulins,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987);和thenumberingsystem(TheInternationalImMunoGeneTicsIinformationLefranc,M.-P.,TheImmunologist7,132-136(1999))。可進行目視檢查和序列分析以確定CDR邊界。就本發明而言,使用Kabat系統和IMGT系統兩者界定CDR序列;即,當由所述兩種系統界定的CDR序列不能完全重疊時,將來自兩個系統界定的序列的所有殘基都包括在內。
本發明的特征在于親源抗體Ab26的變體。Ab26的重鏈和輕鏈氨基酸和核酸的序列分別示于圖10和11。Ab26包含無信號序列的SEQIDNO:3重鏈氨基酸序列和無信號序列的SEQIDNO:4的輕鏈氨基酸序列。
在本發明的一些實施方案中,本發明抗體的CDR在成熟Ab26蛋白質輕鏈CDR1氨基序列的殘基34處和Ab26不同。一些這樣的變化大幅改善該變體抗體的穩定性,而不影響其抗原結合的特性。如果殘基34的突變降低變體抗體的兩種抗原結合親和力,則可在抗體序列(例如,L-CDR1、L-CDR2、 L-CDR2、H-CDR1、H-CDR2或H-CDR3)中進行一個或多個額外的突變以恢復親和力。在一些實施方案中,殘基34從G變成K、R、Q、H、S、Y、A、D、E、F、I、L、M、N、T或V。在本發明的一些實施方案中,抗CD52抗體的L-CDR1序列選自SEQIDNO:24、29、28、22、30、33、18、19、20、21、23、25、26、27、31和32。
本文具體闡述的抗體CDR序列通過其SEQIDNO列于下列表1中。
表1抗CD52抗體的SEQIDNO

抗體H-CDR1H-CDR2H-CDR3L-CDR1L-CDR2L-CDR3Ab1789113435Ab2789123435Ab3789133435Ab4789143435Ab5789153435Ab6789163435Ab7789173435Ab10789183435Ab11789193435Ab12789203435Ab13789213435Ab14789223435Ab15789233435Ab16789243435Ab17789253435Ab18789263435Ab19789273435Ab20789283435Ab21789293435Ab22789303435Ab23789313435Ab24789323435Ab25789333435

在一些實施方案中,本發明的抗體是人源化抗體。本文所用術語“抗CD52人源化抗體”指包含非人來源的抗CD52抗體(也稱為供體抗體(例如鼠類抗CD52抗體))的一個或多個輕鏈CDR(CDR1、CDR2和CDR3)和/或一個或多個重鏈CDR(CDR1、CDR2和CDR3);和人來源的抗體的至少一部分(例如,衍生自人來源的輕鏈和/或重鏈的框架區或框架和恒定區)的抗體。舉例來說,人源化抗體是有或無框架改變的CDR移植抗體。在一些實施方案中,人源化抗體為去免疫化抗體。參見,例如,CarrU.S.Pat.7,264,806,其涉及已經修飾 以減少潛在T細胞表位數量從而降低該抗體施用至人后引發免疫反應傾向的去免疫抗體。
可進行框架區的改變,例如將人來源的框架區殘基用來自供體抗體對應位置的殘基取代的那些改變;參見QueenU.S.Pat.5,530,101。還可進行框架區中的一個或多個突變,包括一個或多個氨基酸的缺失、插入和取代。若需要,人源化抗體中可包括框架突變,且可使用任何適當方法選擇突變位點,舉例來說如WO98/06248和U.S.Pat.6,407,213中所述,其全部內容在本文通過提述并入。在一些情況中,親源框架中在一個或多個CDR旁側的一個或多個氨基酸(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個旁側氨基酸)還可包含于人源化抗體中以增強抗原結合親和力。任選地可在框架區中的一個或多個殘基處進行回復突變以改善人源化抗體的CD52結合親和力。
本發明抗體可因一個或多個殘基的添加、缺失或取代(例如保守性取代)而和抗體Ab26不同,例如,與親源序列的差異高達1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個殘基。
舉例來說,本發明包括抗體,其具有:包含SEQIDNO:59的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的重鏈和包含SEQIDNO:68的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的輕鏈;包含SEQIDNO:59的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的重鏈和包含SEQIDNO:69的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的輕鏈;包含SEQIDNO:59的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的重鏈和包含SEQIDNO:70的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的輕鏈;包含SEQIDNO:59的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的重鏈和包含SEQIDNO:71的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的輕鏈;包含SEQIDNO:59的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的重鏈和包含SEQIDNO:72的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的輕鏈;包含SEQIDNO:59的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的重鏈和包含SEQIDNO:73的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的輕鏈;包含SEQIDNO:59的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的重鏈和包含SEQIDNO:74的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的輕鏈;包含SEQIDNO:59的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的重鏈和包含SEQIDNO:75的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的輕鏈;包含SEQIDNO:59的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的重鏈和包含SEQIDNO:76的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的輕鏈; 包含SEQIDNO:59的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的重鏈和包含SEQIDNO:77的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的輕鏈;包含SEQIDNO:59的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的重鏈和包含SEQIDNO:78的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的輕鏈;包含SEQIDNO:59的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的重鏈和包含SEQIDNO:79的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的輕鏈;包含SEQIDNO:59的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的重鏈和包含SEQIDNO:80的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的輕鏈;包含SEQIDNO:59的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的重鏈和包含SEQIDNO:81的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的輕鏈;包含SEQIDNO:59的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的重鏈和包含SEQIDNO:82的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的輕鏈;包含SEQIDNO:59的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的重鏈和包含SEQIDNO:83的一個或多個CDR(例如全部三個CDR)的輕鏈的抗體。
在一個實施方案中,本發明的抗體具有對人CD52的結合特異性,且包含重鏈(H)-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、輕鏈(L)-CDR1、L-CDR2和L-CDR3,其氨基酸序列分別為:a)SEQIDNO:7、8、9、18、34和35;b)SEQIDNO:7、8、9、19、34和35;c)SEQIDNO:7、8、9、20、34和35;d)SEQIDNO:7、8、9、21、34和35;e)SEQIDNO:7、8、9、22、34和35;f)SEQIDNO:7、8、9、23、34和35;g)SEQIDNO:7、8、9、24、34和35;h)SEQIDNO:7、8、9、25、34和35;i)SEQIDNO:7、8、9、26、34和35;j)SEQIDNO:7、8、9、27、34和35;k)SEQIDNO:7、8、9、28、34和35;l)SEQIDNO:7、8、9、29、34和35;m)SEQIDNO:7、8、9、30、34和35;n)SEQIDNO:7、8、9、31、34和35;o)SEQIDNO:7、8、9、32、34和35;或p)SEQIDNO:7、8、9、33、34和35。
在一些實施方案中,本發明抗體包含SEQIDNO:86(KSSQSLLYSNXKTYLN)的L-CDR1,其中X是天然存在的氨基酸(選自D、E、K、R、H、Y、C、N、Q、S、T、A、V、L、I、M、P、F或W)或非標準(例如非天然)氨基酸。
本發明還涉及本文描述的抗體的抗體輕鏈。在一個實施方案中,所述抗體輕鏈包含選自SEQIDNO:18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32和33的L-CDR1。舉例來說,該抗體具有L-CDR1、L-CDR2 和L-CDR3,其氨基酸序列分別為:a)SEQIDNO:18、34和35;b)SEQIDNO:19、34和35;c)SEQIDNO:20、34和35;d)SEQIDNO:21、34和35;e)SEQIDNO:22、34和35;f)SEQIDNO:23、34和35;g)SEQIDNO:24、34和35;h)SEQIDNO:25、34和35;i)SEQIDNO:26、34和35;j)SEQIDNO:27、34和35;k)SEQIDNO:28、34和35;l)SEQIDNO:29、34和35;m)SEQIDNO:30、34和35;n)SEQIDNO:31、34和35;o)SEQIDNO:32、34和35;或p)SEQIDNO:33、34和35。
表2列舉了本文具體闡述的抗體的全長重鏈和輕鏈及可變結構域氨基酸序列,以及編碼所述重鏈和輕鏈及可變結構域的核苷酸序列的序列識別符(SEQIDNO)。
表2抗CD52抗體的SEQIDNO

在一個實施方案中,本發明抗體包含的輕鏈包含SEQIDNO:68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的可變結構域(VL) 序列。在另一實施方案中,該抗體包含其氨基酸序列含有SEQIDNO:43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58或由SEQIDNO:43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58組成的輕鏈。
在一些實施方案中,本發明抗體包含VH和VL,其氨基酸序列分別包含或其組成為:a)SEQIDNO:59和68;b)SEQIDNO:59和69;c)SEQIDNO:59和70;d)SEQIDNO:59和71;e)SEQIDNO:59和72;f)SEQIDNO:59和73;g)SEQIDNO:59和74;h)SEQIDNO:59和75;i)SEQIDNO:59和76;j)SEQIDNO:59和77;k)SEQIDNO:59和78;l)SEQIDNO:59和79;m)SEQIDNO:59和80;n)SEQIDNO:59和81;o)SEQIDNO:59和82;或p)SEQIDNO:59和83。
在一個實施方案中,本發明抗體包含重鏈(HC)和輕鏈(LC),其氨基酸序列分別包含或其組成為:a)SEQIDNO:3和43;b)SEQIDNO:3和44;c)SEQIDNO:3和45;d)SEQIDNO:3和46;e)SEQIDNO:3和47;f)SEQIDNO:3和48;g)SEQIDNO:3和49;h)SEQIDNO:3和50;i)SEQIDNO:3和51;j)SEQIDNO:3和52;k)SEQIDNO:3和53;l)SEQIDNO:3和54;m)SEQIDNO:3和55;n)SEQIDNO:3和56;o)SEQIDNO:3和57;或p)SEQIDNO:3和58;如果存在,各序列有或無信號序列。
本文還提供完整抗體的部分,例如,所述抗體的輕鏈或重鏈,或輕鏈和/或重鏈的部分。整個抗體的部分包括整個抗體的抗原結合部分。本文中術語“抗原結合片段”和“抗原結合部分”可互換使用。舉例來說,抗體的抗原結合片段包括單鏈抗體、Fv片段、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd片段、單鏈Fv分子(scFv)、scFv-Fc融合體、雙重特異性單鏈Fv二聚體、微型抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、結構域缺失抗體和單結構域抗體(dAbs)。參見例如,NatureBiotechnology22(9):1161-1165(2004))。本發明范圍內還包括包含VH和/或VL的抗原結合分子。在VH的情況中,該分子還可包含CH1區、絞鏈區、CH2區和CH3區中的一個或多個。
可利用酶裂解或重組技術產生抗體的部分或片段。例如,可使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶裂解,分別產生Fab或F(ab’)2片段。還可使用已在天然終止位點的上游引入一個或多個終止密碼子的抗體基因制備呈各種截短形式的抗體。舉例來說可設計編碼F(ab’)2片段重鏈的重組構建體以包含編碼重鏈CH1 結構域和絞鏈區的DNA序列。抗原結合片段保留其親源抗體的結合特異性。優選的抗原結合片段具有對野生型人CD52的結合特異性。可使用PCR誘變方法改變現存DNA序列以構建編碼人源化可變區的核酸(例如,DNA)序列(參見,例如,Kamman,M.,等,Nucl.AcidsRes.17:5404(1989))。編碼新CDR的PCR引物可雜交至基于相同或非常類似的人可變區的、預先人源化的可變區的DNA模板(Sato,K.,等,CancerResearch53:851-856(1993))。如果無可作為模板用的類似DNA序列,則可以合成的寡核苷酸構建包含編碼可變區序列的序列的核酸(參見,例如,Kolbinger,F.,ProteinEngineering8:971-980(1993))。核酸中還可并入編碼信號肽的序列(例如,合成中,插入載體時)。如果無可用的信號肽序列(例如,通常不存在),則可使用另一抗體的信號肽序列(參見,例如,Kettleborough,C.A.,ProteinEngineering4:773-783(1991))。使用這些方法、本文所述的方法或其他適當方法,可容易地制備變體。除非另外表明,否則關于制備和使用本發明抗體的討論還適用于這些抗體的抗原結合片段。
本發明的抗體可為任何同型或亞型,包括IgG(例如,IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgM、IgA(例如,IgA1和IgA2)、IgD和IgE。所述抗體可包含衍生自人κ或λ輕鏈的輕鏈。
另一方面,本發明提供如本文所述抗體或其部分的變體,其中該變體特異性地與人CD52結合,但與參照抗體或其部分有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸取代的不同(例如,在CDR區、FR區或恒定結構域中)。舉例來說,該變體抗體與參照抗體的重鏈、重鏈可變結構域、輕鏈或輕鏈可變結構域至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同。
多肽的序列相似性或同一性通常使用序列分析軟件測定。蛋白分析軟件使用指定給各種取代、缺失和其他修飾(包括保守性氨基酸取代)的相似性量度來匹配相似序列。舉例來說,GCG含有例如“Gap”和“Bestfit”等程序,其可使用缺省參數以確定密切相關多肽間(例如得自不同生物物種的同源多肽或野生型蛋白和其變體蛋白間)的序列同源性或序列同一性。參見,例如,GCGVersion6.1。還可使用采用缺省或建議參數的FASTA(GCGVersion6.1中的程序)比較多肽序列;FASTA(例如,FASTA2和FASTA3)提供查詢和搜尋序列間最優佳重疊區域的比對和序列同一性百分比(Pearson,MethodsEnzymol. 183:63-98(1990);Pearson,MethodsMol.Biol.132:185-219(2000))。比較本發明序列和含有來自不同生物的大量序列的數據庫的另一優選算法為計算機程序BLAST,尤其是使用缺省參數的blastp或tblastn。參見,例如,Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990);Altschul等,NucleicAcidsRes.25:3389-402(1997),其通過提述并入本文。
本文所用的“氨基酸”以其全名、其對應的三字母代碼或其對應的單字母代碼表示,如下表所示:

根據本發明,可進行一種的氨基酸取代類型為改變抗體中可能對另一殘 基(例如但不限于丙氨酸或絲氨酸)具化學反應性的一個或多個半胱氨酸。在一個實施方案中,存在非典型(non-canonical)半胱氨酸的取代。該取代可在抗體的可變結構域的CDR或框架區中或在恒定結構域中進行。在一些實施方案中,該半胱氨酸是典型的。可進行的另一氨基酸取代類型為移除抗體中的潛在蛋白水解位點。這些位點可能存在于抗體的可變結構域的CDR或框架區中或恒定結構域中。半胱氨酸殘基的取代和蛋白水解位點的移除可降低抗體產物中的異質性風險,因此增加其同質性。另一氨基酸取代類型通過改變一個或兩個殘基以消除形成潛在脫酰胺化位點的天冬酰胺-甘氨酸對。本發明的另一方面,使用描述于例如國際專利申請公開WO98/52976和WO00/34317中的技術,可將抗體去免疫化以降低其免疫原性。
可在根據本發明的一種變體中進行的另一氨基酸取代類型為保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸殘基由具有化學性質相似(例如,電荷或疏水性)的側鏈R基團的另一氨基酸殘基取代的取代。一般而言,保守性氨基酸取代不會實質上改變蛋白質的功能性。在兩個或多個氨基酸序列的保守性取代彼此不同的情況下,可向上調整序列序列同一性百分比或相似度以校正該取代的保守性。進行此調整的方法為本領域的技術人員已知。參見,例如,Pearson,MethodsMol.Biol.243:307-31(1994)。
具有化學性質相似的側鏈的氨基酸組的實例包括:1)脂肪族側鏈:甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸;2)脂肪族-羥基側鏈:絲氨酸和蘇氨酸;3)含酰胺的側鏈:天冬酰胺和谷氨酰胺;4)芳香族側鏈:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸;5)堿性側鏈:賴氨酸、精氨酸和組氨酸;6)酸性側鏈:天冬氨酸和谷氨酸;和7)含硫側鏈:半胱氨酸和甲硫氨酸。優選的保守性氨基酸取代組為:纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸及天冬酰胺-谷氨酰胺。可替換地,保守性替換為Gonnet等,Science256:1443-45(1992)中揭示的PAM250對數似然矩陣中具正值的任何變化。"適度保守性"替換乃于PAM250對數似然矩陣中具非負值的任何變化。
在特定的實施方案中,針對本發明抗體或抗原結合部分的氨基酸取代為如下的那些:(1)降低對蛋白水解的敏感性;(2)降低對氧化作用的敏感性;(3)改變結合親和力以形成蛋白質復合物,例如,增強抗體的ADCC和CDC活性;(4)賦予或修飾這些類似物的其他物理化學或功能性質,但仍保留對人 CD52的特異結合;(5)移除C端賴氨酸;和(6)加入或移除糖基化位點。在一些實施方案中,本發明抗CD52抗體重鏈的C端賴氨酸不存在(Lewis等,Anal.Chem,66(5):585-595(1994))。
一方面,本發明提供新型和新穎的多肽,其為本發明抗體的輕(或重)鏈,或為該輕(或重)鏈含可變結構域的部分。這些多肽由于可與相反的重(或輕)抗體鏈配合形成CD52結合分子而是有用的。一旦選定本發明抗體的初始VL或VH結構域,即可實施“混合及匹配”實驗,其中從包含初始選定VL或VH區段的不同配對中,針對CD52結合進行篩選,選出優選VL/VH配對組合。可使用一種界定的可變結構域序列通過篩選可變結構域庫的功能性配偶體可變結構域譜工程化針對CD52的功能性抗體。參見,例如,Clackson等,Nature,352:624-628(1991);Portolano等,J.Immunol.,150:880-887(1993);Beiboer等,J.Mol.Biol.,296:833-849(2000);Klimka等,BritishJournalofCancer,.83:252-260(2000)。
就診斷或分析而言(例如成像以允許例如治療監測),抗體(例如,其抗原結合片段)可包含可檢測的標記。合適的可檢測標記和用于標記抗體或其抗原結合片段的方法為本領域中已知。適當可檢測標記包括舉例來說放射性同位素(例如,銦-111、锝-99m或碘-131);正電子發射標記(例如,氟-19);順磁性離子(例如,釓(III)、錳(II));表位標記(卷標);親和力標記(例如,生物素、抗生物素蛋白);自旋標記;酶;熒光基團或化學發光基團。不使用標記時,可利用表面等離子共振、ELISA、FACS或其他適當方法測定復合物形成(例如,人源化抗體和人CD52間)。
用于本發明的抗CD52抗體和抗原結合片段還可經由例如化學反應或基因修飾偶聯于改善抗體藥物動力學(例如,半衰期)的其他部分(moieties)(例如,聚乙二醇化組分)。在一些實施方案中,用于本發明的抗CD52抗體和抗原結合片段可經由例如化學偶聯或基因修飾連接于適當細胞因子(例如,將細胞因子的編碼序列以符合讀框的方式附加至抗體編碼序列從而產生抗體:細胞因子融合蛋白)。
本發明還涉及免疫偶聯物,其中本發明抗體或抗原結合片段偶聯于另一治療劑,例如生物活性化合物(如,細胞因子、超級抗原、細胞毒性劑和毒素)。舉例來說,抗體或片段可偶聯于植物或細菌來源的分子(或其衍生物)、白介素-2抗體或白喉毒素抗體。
本發明抗體的穩定性
本發明抗體在保存中穩定。相比Ab26展示的穩定性,本發明抗體可具增強的穩定性。穩定性可在保存一段時間后通過測量抗體對CD52的結合親和力顯示。為證明穩定性,可在37℃或45℃和pH7.0、7.5或8.0溫育抗體。可使抗體在含10mM琥珀酸鹽、10mM組氨酸和10mM磷酸鈉、pH7.5的緩沖液中溫育。增強的穩定性可延長至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周或至少10周。
核酸和重組載體
本發明還涉及包含編碼本發明抗體、抗原結合片段、輕鏈、重鏈或可變結構域等序列的分離和/或重組(包括例如基本上純)的核酸分子。
本文中稱為“分離”或“純化”的核酸是已與其原始來源的基因組DNA或細胞RNA的核酸分離出來的核酸(例如,呈存在細胞中或例如數據庫中的核酸混合物),和包括利用本文所述的方法或其他適當方法得到的核酸,包括基本上純的核酸、利用化學合成、組合生物和化學方法制備的核酸,和分離的重組核酸(參見例如,Daugherty,B.L.等,NucleicAcidsRes.,19(9):2471-2476(1991);Lewis,A.P.andJ.S.Crowe,Gene,101:297-302(1991))。
本文中稱為“重組的”核酸是已利用重組DNA方法(包括利用依賴人工重組方法,例如聚合酶連鎖反應(PCR)和/或使用限制酶克隆入載體中等的步驟產生的核酸)制備的核酸。“重組”核酸還可以是因通過細胞天然機制發生的重組事件產生的那些核酸,但是針對在將經設計而容許并使期望重組事件成為可能的核酸引入細胞之后對這些核酸進行了選擇。
更具體而言,本發明還涉及分離的和/或重組核酸,其包含編碼對人CD52具有結合特異性的抗體或該抗體的重鏈或輕鏈或重鏈可變區或輕鏈可變區的核苷酸序列。
在一些實施方案中,核酸分子包含選自SEQIDNO:95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109或110的核苷酸序列,其編碼抗CD52抗體的VL氨基酸序列。在一些實施方案中,核酸分子編碼SEQIDNO:68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的VL氨基酸序列。在一些實施方案中,核酸分子編碼與參照抗CD52 抗體(例如,Ab26)的VL氨基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%完全相同的VL氨基酸序列。編碼Ab26的VL氨基酸序列的核苷酸序列可為SEQIDNO:85。在一些實施方案中,核酸分子編碼包含相比參照抗CD52抗體(例如,Ab26)的VL氨基酸序列含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個突變的VL氨基酸序列。所述突變可位于CDR或FR中。
在一些實施方案中,核酸分子包含選自SEQIDNO:119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134的核苷酸序列,其編碼抗CD52抗體的、有或無信號序列的輕鏈氨基酸序列。在一些實施方案中,核酸分子編碼SEQIDNO:43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58的、有或無信號序列的輕鏈氨基酸序列。在一些實施方案中,核酸分子編碼的輕鏈氨基酸序列和參照抗CD52抗體(例如,Ab26)的輕鏈氨基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%完全相同。編碼Ab26的輕鏈氨基酸序列的核苷酸序列可為有或無信號序列的SEQIDNO:6。在一些實施方案中,核酸分子編碼與參照抗CD52抗體(例如,Ab26)的輕鏈氨基酸序列相比含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個突變的輕鏈氨基酸序列。所述突變可位于CDR、FR或恒定結構域中。
在一些實施方案中,核酸分子包含編碼抗CD52抗體的VH氨基酸序列的核苷酸序列。舉例來說,此核苷酸序列可為SEQIDNO:84。在一些實施方案中,核酸分子編碼的VH氨基酸序列和參照抗CD52抗體(例如,Ab26)的VH氨基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%完全相同。編碼Ab26的VH氨基酸序列的核苷酸序列可為SEQIDNO:84。在一些實施方案中,核酸分子編碼與參照抗CD52抗體(例如,Ab26)的VH氨基酸序列相比含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個突變的VH氨基酸序列。所述突變可位于CDR或FR中。
在一些實施方案中,核酸分子包含編碼抗CD52抗體的、有或無信號序列的重鏈氨基酸序列的核苷酸序列。舉例來說,該核苷酸序列可為有或無信號序列的SEQIDNO:5。在一些實施方案中,核酸分子編碼的重鏈氨基酸序列和參照抗CD52抗體(例如,Ab26)的重鏈氨基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%完全相同。編碼Ab26的重鏈氨 基酸序列的核苷酸序列可為有或無信號序列的SEQIDNO:5。在一些實施方案中,該核酸分子編碼與參照抗CD52抗體(例如,Ab26)的重鏈氨基酸序列相比含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個突變的重鏈氨基酸序列。所述突變可位于CDR、FR或恒定結構域中。
本發明核酸可用于生產對人CD52具結合特異性的人源化抗體。舉例來說,可將編碼本發明人源化抗體的核酸(如,DNA(例如cDNA)或RNA)或一種或多種核酸并入合適的構建體(如重組載體)中用于進一步序列操縱或在適當的宿主細胞中生產編碼的抗體。
本發明還提供適用于表達對人CD52具結合特異性的人源化抗體的構建體或載體(例如,表達載體)。多種載體是可用的,包括在宿主細胞中以單拷貝或多拷貝維持的載體,或整合至宿主細胞染色體中的載體。可將所述構建體或載體引入適當宿主細胞中,然后可在培養物中生產和維持表達本發明人源化抗體的細胞。可使用單一載體或多重載體表達對人CD52具結合特異性的人源化抗體。
適當表達載體(例如,哺乳動物細胞表達載體)還可包含多種組分,其包括但不限下列一種或多種:復制起始點;可選擇的標記基因;一個或多個表達調控元件,例如轉錄調控元件(如,啟動子、增強子、終止子)和/或一個或多個翻譯信號;用于靶向膜或分泌的信號序列或前導序列。在構建體或載體中,信號肽序列可由該構建體或載體或其他來源提供。舉例來說,可使用抗體的轉錄和/或翻譯信號以指導表達。
在合適的宿主細胞中可提供用于表達的啟動子。啟動子可為組成型或誘導型的。舉例來說,啟動子可操作地連接于編碼人源化抗體或抗體鏈的核酸,進而其可指導編碼多肽的表達。有多種適當的啟動子可用于原核(例如,大腸桿菌的lac、tac、T3、T7啟動子)和真核(例如,酵母醇脫氫酶(ADH1)、SV40、CMV)宿主。本領域的技術人員具有選擇用于表達本發明抗CD52抗體或其部分的合適啟動子的能力。
此外,載體(例如,表達載體)一般包含用于選擇攜帶該載體的宿主細胞的可選擇標記,并且在復制載體的情況中包含復制起始點。編碼賦予抗生素或藥物抗性的產物的基因為常見的可選擇標記,并可用于原核細胞(例如,β-內酰胺酶基因(氨芐青霉素(ampicillin)抗性)、Tet基因(四環霉素抗性)和真核細胞(例如,新霉素(G418或遺傳霉素(geneticin))、gpt(霉酚酸)、氨芐青霉素或潮 霉素抗性基因)。二氫葉酸還原酶標記基因允許在各宿主中以氨甲喋呤選擇。編碼宿主的營養缺陷標記基因產物的基因(例如,LEU2、URA3、HIS3)常在酵母中作為可選擇標記用。還涵蓋使用病毒(例如,桿狀病毒)或噬菌體載體和能整合入宿主細胞基因組內的載體(例如逆轉錄病毒載體)。
本發明因此涉及編碼本發明的人源化抗體、人源化輕鏈、人源化重鏈的分離核酸分子。本發明還涉及編碼抗體的抗原結合部分及其鏈的分離核酸分子。由本發明核酸編碼的多肽序列描述于上文和下列實施例中。
在一些實施方案中,本發明的核酸或載體編碼本發明的重鏈(或其抗原結合部分)或輕鏈(或其抗原結合部分)。在其他實施方案中,本發明的核酸或載體編碼本發明的重鏈和輕鏈(或其抗原結合部分)兩者。可使用含有重鏈編碼核酸和輕鏈編碼核酸或編碼重鏈和輕鏈兩者的單一核酸的宿主細胞制備包含重鏈和輕鏈(或抗體的抗原結合部分)的抗體。重鏈編碼核酸和輕鏈編碼核酸可置于分開的表達載體中。這些還可置于單一表達載體中處于相同或不同表達調控下。參見,例如,CabillyU.S.Pat.6,331,415;FangU.S.Pat.7,662,623。
生產具有對人CD52特異性的抗體的方法
本發明另一方面涉及制備本發明抗人CD52抗體的方法。本發明抗體舉例來說可通過在適當宿主細胞中表達編碼該抗體的一種或多種重組核酸產生。該宿主細胞可使用任何適當方法產生。舉例來說,可將本文所述的表達構建體(如,一種或多種載體,例如,哺乳動物細胞表達載體)引入適當宿主細胞中,然后將所得細胞維持在適于構建體或載體表達的條件下(例如,在培養物中、動物中、植物中)。適當的宿主細胞可為原核細胞,包括細菌細胞(例如大腸桿菌(例如,DH5αTM株(Invitrogen,Carlsbad,Calif.))、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和/或其他合適的細菌);真核細胞例如真菌或酵母細胞(例如,巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、曲霉屬菌種(Aspergillussp.)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、粗糙脈孢霉(Neurosporacrassa)或其他低等真核細胞),以及高等的真核生物細胞,例如來自昆蟲的細胞(例如,果蠅施耐德(Schnieder)S2細胞、Sf9昆蟲細胞(WO94/26087(O’Connor)、TN5B1-4(HIGH5)昆蟲細胞(Invitrogen)、哺乳動物的細胞(例如,COS細胞,例如,COS-1(ATCC登錄編號CRL-1650)和COS-7(ATCC登錄編號CRL-1651),CHO(例如,ATCC登錄編號CRL-9096),CHO DG44(Urlaub,G.andChasin,LA.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77(7):4216-4220(1980)),293(ATCC登錄編號CRL-1573),HeLa(ATCC登錄編號CCL-2),CV1(ATCC登錄編號CCL-70),WOP(Dailey,L.,等,J.Virol.,54:739-749(1985)),3T3,293T(Pear,W.S.,等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:8392-8396(1993)),NS0細胞,SP2/0細胞,HuT78細胞等),或植物的細胞(例如,煙草、青萍(浮萍)和藻類)。(參見,例如,Ausubel,F.M.等,eds.CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociatesandJohnWiley&SonsInc.(1993))。在一些實施方案中,宿主細胞不是多細胞生物(例如,植物或動物)的一部分,例如其為分離的宿主細胞或細胞培養物的一部分。
本發明還涉及包含本發明核酸(如載體(例如,表達載體))的細胞。舉例來說,編碼人源化抗體(該抗體具有對人CD52的結合特異性)的重鏈和輕鏈的核酸(即一個或多個核酸)或包含這些核酸的構建體(即一種或多種構建體,例如,一種或多種載體)可通過適于所選定宿主細胞的方法(例如,轉化、轉染、電穿孔、感染)引入適當宿主細胞中(例如,于載體中、經由細胞中的進程產生的構建體中、整合至宿主細胞基因組中),其中所述核酸與一個或多個表達調控組件可操作地連接或變成與一個或多個表達調控組件可操作地連接。在適于表達的條件下(例如,在誘導物、補充適當鹽類、生長因子、抗生素、營養補充物等的適當培養基存在時)維持宿主細胞從而生產編碼多肽。需要時,舉例來說,可從宿主細胞、培養基或乳(milk)中分離該編碼蛋白質(例如,人源化抗體、小鼠抗體、嵌合抗體)。此過程涵蓋于轉基因動物或植物(例如,煙草)的宿主細胞(例如,乳腺細胞)中的表達(參見例如,WO92/03918)。
可制備其中抗體部分(例如,抗原結合片段;抗體鏈)連接于融合蛋白N端位置、C端位置或內部位置的非抗體組分(即不出現于天然存在抗體中的組分)的融合蛋白。舉例來說,一些實施方案可通過于適當表達載體(例如,pET載體(如pET-15b,Novagen)、噬菌體載體(如,pCANTAB5E,Pharmacia)或其他載體(如,pRIT2T蛋白質A融合載體,Pharmacia))中插入編碼抗體序列的核酸予以制備。將所得構建體引入適當宿主細胞中表達。表達后,若干融合蛋白可利用適當親和性基質從細胞溶解物中分離或純化(參見,例如,CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel,F.M.等,Eds.,Vol.2,Suppl.26,pp.16.4.1-16.7.8(1991))。
本發明涉及包含編碼本文所提供抗體(例如,抗體、輕鏈或重鏈、輕鏈可 變區或重鏈可變區)的重組核酸的宿主細胞。本發明還涉及包含編碼抗體或其鏈的抗原結合部分的重組核酸的宿主細胞。在一些實施方案中,宿主細胞包含本文提及的本發明的重組載體(例如,表達載體、哺乳動物細胞表達載體)。
本發明還涉及制備本發明抗體或抗體多肽鏈的方法。在一個實施方案中,該方法包括在適于表達抗體或多肽鏈的條件下維持本文所述的本發明宿主細胞(例如,包含編碼抗體或多肽鏈(例如,本發明的輕鏈和重鏈、僅輕鏈或僅重鏈)的一個或多個分離核酸的宿主細胞)。舉例來說,宿主細胞可培養于基質上或懸浮液中。在一些實施方案中,該方法進一步包括純化或分離抗體或多肽鏈的步驟。
可使用偶聯于DYNABEADSM-270胺(Dynal)的CD52根據制造商的建議進行選擇。可替換地,使用生物素化的CD52的選擇,可使用伯胺特異性試劑琥珀酰亞氨基-6-(生物素氨基)己酸酯依照制造商使用說明書(EZlinkNHSLCBiotin,Pierce)制備。
來自選擇的產物(outputs)可作為周質(periplasmic)制備物根據測量scFv或IgG競爭與CD52結合的能力的競爭分析以高通量篩選測試。
能在高通量篩選中競爭的樣品可如Vaughan等(1996)和Osburn等(1996)中所述進行DNA測序。隨后使克隆表達并純化為scFv或IgG并使用例如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)分析和補體依賴性細胞毒性(CDC)分析等分析法評估其結合CD52、中和CD52或其組合的能力。隨后可如WO01/66754實施例3中所述制備純化scFv制備物。純化scFv或IgG制備物的蛋白質濃度可使用BCA方法(Pierce)測定。類似方法可用于篩選固定抗體重鏈或輕鏈(或VH或VL)的最優配偶體(相對鏈)。
本發明抗體可以是純化或分離形式(如,已和其原始來源(如,細胞上清液,混合物中,例如在文庫中的抗體混合物中)的分子(如肽)分開);及包括利用本文所述的方法或其他適當方法得到的抗體。分離抗體包括基本上純(實質上純)的抗體和通過化學合成、重組技術和其組合產生的抗體。
含毒素部分或毒素的抗體
本發明還涉及包含毒素部分或毒素的抗體。適當的毒素部分包含毒素(例如,表面活性毒素、細胞毒素)。毒素部分或毒素可使用任何適當方法連接或偶聯于抗體。舉例來說,毒素部分或毒素可直接或通過適當接頭共價與抗體 鍵合。適當接頭可包括不可裂解或可裂解的接頭,例如,pH可裂解接頭或包含供細胞酶用的切割位點的接頭。這些可裂解接頭可用于制備抗體內化后能釋放毒素部分或毒素的抗體。
可使用多種方法將毒素部分或毒素連接或偶聯至抗體。所選的特定方法取決于毒素部分或毒素及想要連接或偶聯的抗體。需要時,可使用含末端功能基團的接頭以連接抗體和毒素部分或毒素。通常,偶聯通過含反應性功能基團的毒素部分或毒素(或經修飾以含有反應性功能基團)和接頭或直接和抗體反應而完成。共價鍵的形成通過含(或經修飾而含)化學部分或功能基團的毒素部分或毒素在適當條件下與第二個化學基團反應從而形成共價鍵進行。需要時,可使用任何適當方法,添加適當反應性化學基團于抗體或接頭。(參見,例如,Hermanson,G.T.,BioconjugateTechniques,AcademicPress:SanDiego,Calif.(1996))。許多合適的反應性化學基團組合為本領域中已知,舉例來說,氨基可與親電子基團(例如,甲苯磺酸根、甲磺酸根、鹵素、N-羥基琥珀酰亞氨基酯(NHS)等)反應。硫醇類可與順丁烯二酰亞胺、碘代乙酰基、丙烯酰基、吡啶基二硫化物、5-硫醇基-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇基)等反應。醛功能基團可偶聯至含胺或酰肼的分子,而疊氮基團可與三價磷基反應以形成氨基磷酸酯或磷酰亞胺等連接基。引入活化基團至分子中的適當方法為本領域中已知(參見例如,Hermanson,G.T.,BioconjugateTechniques,AcademicPress:SanDiego,Calif.(1996))。
適當的毒素部分和毒素包括,例如,美登木素生物堿(maytansinoid)、紫杉烷、卡奇霉素(calicheamicin)、多卡霉素(duocarmycin)或其衍生物。美登木素生物堿可為,例如,美登醇(maytansinol)或美登醇類似物。美登醇類似物的實例包括具有修飾的芳香族環的那些和在其他位置具有修飾的那些。美登醇和美登醇類似物描述于例如美國專利5,208,020和6,333,410中,其在本文通過提述并入。美登醇可使用例如3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(還為所謂4-(2-吡啶二硫代)戊酸N-琥珀酰亞胺酯(或SPP))、4-琥珀酰亞氨基-氧羰基-a-(2-吡啶二硫代)-甲苯(SMPT)、3-(2-吡啶二硫代)丁酸N-琥珀酰亞胺酯(SDPB)、2-亞氨基硫烷(iminothiolane)或S-乙酰基琥珀酸酐偶聯至抗體和抗體片段。紫杉烷可為例如紫杉醇、泰索帝(taxotere)或新型紫杉烷(參見,例如,WO01/38318)。卡奇霉素可為例如溴復合卡奇霉素、碘復合卡奇霉素或其類似物和模擬物。溴復合卡奇霉素包括I1-BR、I2-BR、I3-BR、I4-BR、J1-BR、 J2-BR和K1-BR。碘復合卡奇霉素包括I1-I、I2-I、I3-I、J1-I、J2-I、L1-I和K1-BR。卡奇霉素及其突變體、類似物和模擬物描述于例如美國專利4,970,198、5,264,586、5,550,246、5,712,374和5,714,586中,其每一篇的內容在本文通過提述并入。多卡霉素類似物描述于例如,美國專利5,070,092、5,187,186、5,641,780、5,641,780、4,923,990和5,101,038中,其每一篇的內容在本文通過提述并入。
其他毒素的實例包括但不限于,抗代謝物、烷化劑、蒽環類、抗生素和抗有絲分裂劑。毒素還可為表面活性毒素(例如本身為自由基產生劑的毒素)或含放射性核素的部分。毒素可以是蛋白、多肽或肽,例如來自細菌來源或植物蛋白質。
設計用于負責結合、失效、促進降解或阻止生成產生特定靶蛋白的mRNA的核酸反義化合物也可作為毒素使用。反義化合物包括反義RNA或DNA、單或雙鏈、寡核苷酸或其類似物,其可特異性地與獨特的mRNA類型雜交,并組織該mRNA類型的轉錄和/或RNA加工和/或編碼多肽的翻譯,從而造成相應編碼多肽的量減少。Ching,等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:10006-10010(1989);Broder,等,Ann.Int.Med.113:604-618(1990);Loreau,等,FEBSLetters274:53-56(1990)。
毒素還可為光活性劑。適當的光活性劑包括基于卟啉的材料如卟吩姆鈉(porfimersodium)、綠色卟啉、二氫卟吩(chlorin)E6、血卟啉衍生物本身、酞菁素、初紫紅素(etiopurpurins)、替沙林(texaphrin)等。毒素可為結合細胞內標靶的抗體或抗體片段。這些抗體或抗體片段可被引導至限定的亞細胞區室或標靶。
治療方法和組合物
藥物組合物包含治療上有效量的一種或多種抗體和任選的藥物上可接受的載劑。藥物上可接受的載劑包括例如,水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽液、葡萄糖、甘油、乙醇等及其組合。藥物上可接受的載劑可進一步包含少量輔助物質例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液,其增強融合蛋白質的保存期限或有效性。可配制組合物以提供給藥后活性成分的快速、持續或延后釋放。適當的藥物組合物及其制備方法為本領域已知。參見,例如,Remington(2005),TheScienceandPracticeofPharmacy,A.Gennaro,等,eds.,21sted.,Mack PublishingCo.。藥物組合物可進一步包含免疫抑制/免疫調節和/或抗炎劑。在需要這些治療的患者中治療免疫疾病的方法可包括施用治療有效量的藥物組合物至該患者。舉例來說,在自身免疫、移植排斥或變應反應期間,拮抗CD40介導的T細胞活化可抑制不需要的T細胞反應發生。抑制CD40介導的T細胞活化可緩和這些疾病的進展和/或嚴重性。
本文所用的“患者”指動物,例如,哺乳動物,包括人。患者可能診斷患有免疫疾病或癌癥。“治療”指涉及減輕癥狀、病癥、病況或疾病進展或嚴重性的過程。“免疫疾病”指任何與個體免疫反應(包括細胞性和/或體液性免疫反應)的形成相關的疾病。免疫疾病的實例包括但不限于,炎癥、過敏、自身免疫疾病或與移植相關的疾病。自身免疫疾病可選自系統性紅斑狼瘡、多發性硬化、類風濕性關節炎、糖尿病、牛皮癬、硬皮癥、動脈粥樣硬化、炎性腸病和潰瘍性結腸炎。
本發明抗體可用于免疫抑制和免疫切除。所述抗體靶向表達CD52的細胞(例如,T和B細胞),且在對其有需要的受試者中減小(或如本文所用的“消耗”)其群體。淋巴細胞的消耗可用于治療多種疾病和癥狀,例如發炎、自身免疫疾病和癌癥(例如,淋巴細胞(B細胞或者T細胞)惡性腫瘤)。參見,例如,Reiff,A.,Hematology,10(2):79-93(2005)。可用本發明抗體或抗原結合部分治療的疾病和癥狀的實例包括但不限于多發性硬化癥、狼瘡、類風濕性關節炎、移植物抗宿主病(GVHD)、炎性腸病、血管炎、貝塞特氏(Behcet’s)病、韋格納肉芽腫、干燥綜合征(Sjogren’ssyndrome)、葡萄膜炎、牛皮癬、硬皮癥、多發性肌炎、1型(自身免疫型)糖尿病、自身免疫性血細胞減少癥(例如自身免疫嗜中性粒細胞減少癥、輸血依賴性頑固PRCA、白血病和淋巴瘤例如有巨大腫塊(bulkydisease)的非霍奇金氏淋巴瘤和B細胞慢性淋巴性白血病(CLL)。抗體還可預防性施用以預防炎癥的發病,或自身免疫疾病或癌癥的復發。舉例來說,本發明抗體可以作為調理療法的一部分施用,為患者的移植(例如,干細胞移植、同種異體T細胞的自身輸注或實體器官移植)作準備。在一些實施方案中,本發明抗體和抗原結合部分是用于制備治療免疫疾病或癌癥的藥物。
可使用任何適當方法或途徑施用抗體多肽或藥物組合物。根據要治療的疾病或癥狀,給藥途徑包括,例如,腸胃外(例如靜脈內、動脈內、肌內、脊髓腔內、腹膜內、皮下注射)、口服(例如飲食)、局部、表皮、吸入(例如支氣 管內、鼻內或口腔吸入、鼻腔滴入)或經直腸。施用抗體多肽的治療有效劑量取決于多種因素,包括例如治療的免疫疾病的類型和嚴重性、聯合療法的使用、抗體多肽或藥物組合物的給藥途徑和患者體重。抗體治療有效量的非限制性范圍相對于患者體重為0.1-20毫克/千克;一方面,為1-10毫克/千克。抗體多肽的劑量可由在疾病狀態的體外和/或體內模型中的CD52拮抗作用所需抗體多肽的量進一步指導。
本發明抗體可在醫療保健提供者認為合適的任何時間點以單一單位劑量或多劑量施用。所述劑量可通過本領域中已知的方法確定,且可根據例如,個體的年齡、敏感性、耐受性及整體健康狀態而定。抗體或其部分可在為期數小時(例如,3、4、5或6小時)的輸注中施用。抗體或部分可以各種適當的方案進行施用,例如,在持續的2、3、4、5或6天,以一個或多個周期,其間隔為3個月或3個月以上(例如,12或24個月)。任何周期中施用的抗CD52抗體的總劑量可為10至60毫克。在一個實施方案中,本發明的抗體或部分使用與相同的給藥方案施用。
本發明抗體可單獨或在聯合療法中連同另一作用劑(例如,免疫抑制劑)施用至個體(例如,人)。該抗體可在其他作用劑給藥前、一起或之后施用。在一些實施方案中,其他作用劑為,例如,抗炎化合物如柳氮磺胺吡啶、另一非類固醇類抗發炎化合物或類固醇類抗炎化合物。在一些實施方案中,其他作用劑為另一消耗淋巴細胞抗體,例如另一抗CD52抗體、抗CD20抗體、抗BAFF抗體、抗BAFF-R抗體等。在一些實施方案中,其他作用劑為,例如,細胞因子(例如,IL-7)、抗細胞因子受體抗體或可溶性受體,其偏離、操縱和/或加強由抗CD52抗體介導的淋巴細胞消耗后發生的重構過程(參見,例如,Sportes等,“CytokineTherapies:Ann.N.Y.Acad.Sci.1182:28-38(2009))。在另一實施方案中,合成的肽模擬物可與本發明抗體一起施用。
由于本發明抗體靶向CD52表達細胞,因此所述抗體還可用于消耗T細胞和B細胞以外的CD52+細胞類型。舉例來說,研究已顯示,血管白細胞(VLC)和Tie2+單核細胞(表達高水平CD52的髓樣細胞)促進腫瘤血管生成及促成對抗VEGF療法的腫瘤抗性。Pulaski等,J.TranslationalMed.7:49(2009)。本發明的抗CD52抗體因而可經由靶向VLC和Tie2+單核細胞而抑制腫瘤血管生成。對于該目的,抗CD52抗體可全身性或局部施用于新血管形成位點(例如腫瘤部位)。抗CD52抗體療法可與標準照護癌癥治療(例如化學療法、外科手 術或放射)或與另一靶向療法(例如抗VEGF抗體療法)一起使用。抗CD52抗體療法可用于治療,例如,乳癌、肺癌、神經膠質瘤、結腸直腸癌和抗VEGF抗體的任何其他征兆。抗CD52抗體療法還可用于其他新血管形成癥狀,包括非致癌的新血管形成癥狀。
研究已顯示,阿侖單抗的淋巴細胞消耗通過嗜中性粒細胞和NK細胞介導(Hu等,Immunology128:260-270(2009))。因此,在聯合療法的實施方案中,可在抗CD52抗體療法的前、期間或之后施用刺激嗜中性粒細胞和NK細胞的制劑至患者以增強抗體療法。刺激嗜中性粒細胞和/或NK細胞包括但不限于(1)增加其分裂速率;(2)增加其對應于抗CD52抗體同型的Fc受體(例如,FcγRIIIa和FcγRIIIb、FcγRII、FcγRI及FcαRI)的細胞表面表達;(3)動員和增加循環的細胞數;(4)招募細胞至靶位點(例如,腫瘤、發炎或組織損傷的位點);(5)和增加其細胞毒性活性。刺激嗜中性粒細胞和/或NK細胞制劑的實例包括例如粒細胞單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)(例如,或沙格司亭(sargramostim)和莫拉司亭(molgramostim));粒細胞集落刺激因子(G-CSF)(例如,或非格司亭(filgrastim)、聚乙二醇化非格司亭和來格司亭(lenograstim));干擾素-γ(例如,);CXC趨化素受體4(CXCR4)拮抗劑(例如,MOZOBILTM或普樂沙福(plerixafor));及CXC趨化因子受體2(CXCR2)激動劑。患者的嗜中性粒細胞數可定期監測以確保最優治療效力。患者的嗜中性粒細胞數還可在開始抗CD52抗體治療前測量。刺激劑的量可根據患者的嗜中性粒細胞數調整。如果患者具有比正常更低的嗜中性粒細胞數,則可使用較高劑量的刺激劑。在嗜中性粒細胞減少期間,其可能是由于使用抗CD52抗體治療所引起,還可施用較高劑量的嗜中性粒細胞刺激劑以最大化抗CD52抗體的效果。
由于嗜中性粒細胞和/或NK刺激改善抗CD52抗體療法的效力,因此聯合療法的該實施方案允許在患者中使用較少抗體而同時保持類似的治療功效。在保持治療功效的同時使用較少抗CD52抗體有助于降低抗CD52抗體的副作用,包括患者對所施用抗體的免疫反應和形成次級自身免疫(抗CD52抗體治療期間或之后產生的自身免疫)。聯合療法的該實施方案還可用于腫瘤科設置,例如,在患者患有嗜中性粒細胞減少癥時。
在聯合療法的另一實施方案中,可使用調節型T細胞刺激劑加強抗CD52抗體療法。已證實相比其他CD4+T細胞,抗CD52抗體消耗CD4+CD25+FoxP3+ 調節型T細胞的程度小得多。調節型T細胞(還稱為“Treg”或抑制型T細胞)是能經由接觸依賴性或無關接觸(例如,產生細胞因子)的機制抑制其他類淋巴細胞增殖和/或功能的細胞。已對數種類型調節型T細胞進行了描述,包括γδT細胞、天然殺傷T(NKT)細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞和雙陰性CD4-CD8-T細胞。參見,例如,Bach等,Immunol.3:189-98(2003)。CD4+CD25+FoxP3+調節型T細胞已稱為“天然存在”的調節型T細胞;其表達CD4、CD25和叉頭家族轉錄因子FoxP3(叉頭盒p3蛋白(forkheadboxp3))。因此,在聯合療法的該實施方案中,可在抗CD52抗體療法之前、期間或之后施用刺激CD4+CD25+FoxP3+調節型T細胞的制劑,以在淋巴細胞消耗后破壞(skew)免疫系統的組成。該制劑可,例如,活化這些T細胞、穩定和/或擴大所述細胞的群體、動員及增加細胞的循環和/或招募細胞至靶位點。這些制劑的實例為雷帕霉素(rapamycin);活性或潛伏的TGF-β(例如,TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4和TGF-β5);IL-10;IL-4;IFN-α;維生素D(例如,維生素D3);地塞米松(dexamethasone);和霉酚酸酯(mycophenolatemofetil)(參見,例如,Barrat等,J.Exp.Med.195:603-616(2002);Gregori等,JImmunol.167:1945-1953(2001);Battaglia等,Blood105:4743-4748(2005);Battaglia等,J.Immunol.177:8338-8347(2006))。
本發明中用于治療疾病的抗CD52抗體的有效量為幫助經治療受試者達到一個或多個預期臨床終點(clinicalendpoint)的量。例如,就狼瘡而言(其癥狀包括系統性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、皮膚性紅斑狼瘡、CNS狼瘡、心血管癥狀、肺部癥狀、肝臟癥狀、血液癥狀、胃腸癥狀、肌肉骨骼癥狀、新生兒狼瘡、兒童系統性紅斑狼瘡、藥物引起的紅斑狼瘡、抗磷脂綜合征和導致狼瘡癥狀的補體缺陷綜合征;參見,例如,RobertG.Lahita,Editor,SystemicLupusErythematosus,4thEd.,ElsevierAcademicPress,2004),可經由監測受影響的器官系統(例如,狼瘡性腎炎的血尿和/或蛋白尿),和/或使用提供跨越數個器官系統的疾病嚴重性復合分數(例如,BILAG、SLAM、SLEDAI、ECLAM)的疾病活性指數,測量臨床終點。參見,例如,Mandl等,“Monitoringpatientswithsystemiclupuserythematosus”inSystemicLupusErythematosus,4thedition,pp.619-631,R.G.Lahita,Editor,ElsevierAcademicPress,(2004)。
本發明抗體或其部分可用于治療之前已用治療,并對形成中和抗體的個體(例如,頑固型個體)。舉例來 說,可治療先前已以治療(例如,以一個或多個治療療程)并對形成降低進一步治療功效的中和抗體的、具自身免疫疾病(例如,多發性硬化癥、狼瘡、血管炎)和/或癌癥(例如,白血病(如,慢性淋巴性白血病)、淋巴瘤(例如,非霍奇金氏淋巴瘤))的個體。另一實施方案中,可用本文所述的其他人源化抗體之一治療已成為難以本文所述的特定人源化抗體治療的個體。
舉例來說,本發明的抗體或其部分對于治療多發性硬化癥(MS)是有效的治療劑。MS包括復發緩解型、繼發進行型、原發進行型和進行復發型多發性硬化癥(Lublin等,Neurology46(4),907-11(1996)),其通過例如癥狀史和在例如核磁共振造影(MRI)、脊椎穿刺、誘發電位測試和血液樣品的實驗室分析等檢測幫助下的神經系統檢查進行診斷。在MS中,治療的目標是為了降低復發的風險、頻率和/或嚴重性,預防或降低由疾病進展引起的失能和促進組織修復。因此,幫助實現與一個或多個這些目標一致的臨床終點的抗CD52抗體量為抗體的治療有效量。舉例來說,本發明的抗CD52抗體或其部分顯示可用于治療MS復發型以減緩或逆轉身體失能的累積和降低臨床急性發作的頻率。該抗體或其部分可在臨床試驗中測試其在降低復發風險和臨床上顯著失能的進展風險的效力。該抗體或其部分可施用至具有活性復發或有形成復發的風險的患者或正在經歷進行性功能退化的患者。參見例如,美國專利公開2008/0267954,其全部內容在本文通過提述并入。
本發明的方法和組合物可用于治療對之前的MS修飾療法反應欠佳的MS患者。該MS患者可為復發緩解型(RRMS)患者,其先前已接受MS修飾療法,例如,干擾素β-1a(如)、干擾素β-1b(如)、乙酸格拉默(glatirameracetate)(如)、米托蒽醌(mitoxantrone)(如)、那他珠單抗(natalizumab)(如)、芬戈莫德(fingolimod)(如)和特立氟胺(teriflunomide)(如AUBAGIOTM)。在一個實施方案中,先前的MS修飾療法并非阿侖單抗(如,CAMPATH、MABCAMPATH或LEMTRADATM)或另外的抗CD52抗體。該之前治療的患者可能在正在治療或治療后不久(例如,一年之內)具有MS復發或更新(renewd)的MS活性。更新的MS活性可包括歸因于MS的新或惡化的神經癥狀、患者EDSS評分增加(Kurtzke,Neurology1983;33:1444-52)、患者多發性硬化癥功能復合量表(MSFC)評分減少(Cutter 等,Brain1999;122(Pt5):871-82)、新的或增大的腦或脊髓損傷、腦容積損失和/或通過光學相干斷層掃描(OCT)確定的神經退化。例如,當患者以干擾素β或格拉默治療時,可能已至少具有一次在先的復發。患者還可能具有至少一種下述特征:在開始第一個周期抗CD52抗體治療的前10年或少于10年的癥狀發作;在開始第一個周期抗CD52抗體治療的前兩年內至少發作兩次;在用干擾素β或格拉默治療至少6個月后,至少有一次復發;擴展失能狀態量表(EDSS)評分5.0或更低;和腦和脊髓的核磁共振造影(MRI)異常。
在一個實施方案中,本發明抗體或其部分施用至具有自身免疫疾病(例如多發性硬化癥(MS))的MS患者,其給藥方案包含施用第一個周期抗體,隨后為至少一個另外的周期的抗體,其中各治療周期包含以連續天數施用1至5個劑量,且其中各治療周期與下一周期至少間隔1至24個月(例如,12個月)。舉例來說,在一個實施方案中,具有多發性硬化癥的患者以包含5個抗體日劑量的第一個周期抗體治療,隨后為至少一個另外的周期的抗體治療,其中該治療發生于第一個周期的后一年,并包含以連續天數施用3個抗體劑量。在一個實施方案中,抗CD52抗體于第一個治療周期中以12毫克/天,5個連續天數施用至具有多發性硬化癥的患者;并在一年后,在第二個治療周期中,以12毫克/天,三個連續天數對該患者施用抗CD52抗體。在一個實施方案中,抗CD52抗體是在第一個治療周期中于5個連續天數期間以60毫克的總劑量施用至具有多發性硬化的患者;并在一年后,第二個治療周期中,在3個連續天數期間以36毫克的總劑量對該患者施用抗CD52抗體。
本發明的方法和組合物中,“年”無需正好等于365天或12個月。舉例來說,抗CD52抗體的第二個周期無需在施用抗CD52抗體第一個周期的后正好365天或12個月施用。第二個周期可在第一個周期開始后365天加或減多達6個月、加或減多達5個月、加或減多達4個月、加或減多達3個月、加或減多達2個月、加或減多達1個月、加或減多達4周、加或減多達3周、加或減多達2周或加或減多達1周開始。
另一實施方案中,患有MS的患者僅在一旦觀察到更新MS活性的證據時才進行再治療(參見例如WO2008/031626,其全部內容在本文通過提述并入)。在一些實施方案中,如果具有更嚴重形式的MS或更進展形式的其他自身免疫疾病(例如血管炎;參見,例如,Walsh等,AnnRheumDis67:1322-1327(2008))的患者在其最后治療過程后經歷提早復發或顯示更新的MS活性,則 可能有必要施用更頻繁的治療過程(例如,每4個月、每6個月)。更新MS活性的證據可使用臨床醫師可用的任何方法根據進行治療的臨床醫師的專業判斷而確定。目前有多種技術可供臨床醫師用以診斷更新MS活性,其包括但不限于臨床方法(神經系統失能的復發或進展)或通過腦或脊髓的核磁共振造影(MRI)。如醫師已知,經由MRI檢測的疾病活性可由T1(增強或未增強)或T2加權成像大腦或脊髓新損傷的出現或由此類損傷體量的增加來指示。
由于MS診斷方法正持續發展,預期未來可能有更多檢測更新MS活性的方法(例如,磁化轉化比率或MR光譜術)。用于檢測更新MS活性的特定診斷方法不是本發明申請專利范圍的限定內容。在特定實施方案中,治療周期后以固定時間間隔進行重復的MRI以確定任何特定患者是否有必要再治療及此類患者再治療的最佳時間點。通常希望在臨床上疾病再顯現前進行再治療。
本發明的方法和組合物可與其他MS修飾療法組合使用。MS修飾療法的非限制性實例包括干擾素β-1a(例如,)、干擾素β-1b(例如,)、醋酸格拉默(例如,)、米托蒽醌(例如,)、那他珠單抗(例如,)、芬戈莫德(例如,)和特立氟胺(例如,)。
在一些實施方案中,本發明的方法和組合物可與一般化或非特定治療或療法(例如,類固醇類(如,皮質類固醇類)或達伐吡啶(dalfampridine)(如,))組合使用。
一方面,可于輸注抗CD52抗體之前、期間或之后施用本領域的技術人員已知的能有效處理輸注相關副作用的藥物。這些藥物包括皮質類固醇類(例如,甲潑尼龍)、乙酰胺酚和抗組胺類(例如苯海拉明(diphenhydramine))。在一些實施方案中,患者在以本發明抗體治療的周期期間于1、2、3、4或5個連續天靜脈內注射接受1克/天的甲潑尼龍。
于本發明的一實施方案中,患者可另外接受作為預防皰疹用的藥物。舉例來說,患者可于本發明抗體給藥期間和之后的28天每天兩次接受200毫克的無環鳥苷(acyclovir)(例如,)。
制劑根據所選定的給藥途徑而不同(例如,溶液、乳液)。包含欲施用的抗體或抗原結合片段的適當組合物可制備于生理上可接受的載體或載劑中。該組合物可包含多劑量或為單一單位劑量的組合物。就溶液或乳液而言,合適的載劑包括,例如,水性或醇/水溶液、乳液或懸浮液,包括鹽水和緩沖介質。 腸胃外載體可包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發油。靜脈內媒劑可包括各種添加劑、防腐劑或流體、營養物或電解質補充劑(一般參見,Remington’sPharmaceuticalSciences,17thEdition,MackPublishingCo.,PA,1985)。就吸入而言,可將化合物溶解并裝填至給藥用的適當分配器中(例如,霧化器(atomizer)、噴霧器(nebulizer)或加壓的氣溶膠分配器)。
診斷方法和組合物
本發明抗體還可用于研究和診斷上應用的各種方法。舉例來說,其可用于檢測、分離和/或純化人CD52或其變體(如通過親和純化或其他適當方法,例如,流式細胞測量術,如用于懸浮液中的細胞(如淋巴細胞)和研究人CD52結構(如構象)和功能。本發明的抗體可用于體外應用。
本發明抗體可用于診斷應用(如體外、離體)。舉例來說,本發明的人源化抗體可用于檢測和/或測量樣品中的人CD52水平(如在組織或體液中--例如攜帶人CD52的炎性滲出液、血液、血清、腸液、組織--表達人CD52的細胞)。樣品(如組織和/或體液)可獲自個體,且可使用本文所述的抗體以適當免疫方法檢測和/或測量人CD52的表達;包括的方法例如流式細胞測量術(如用于懸浮液中的細胞,例如淋巴細胞),酶免疫分析法(ELISA),包括化學發光分析、放射性免疫分析和免疫組織學。本發明涵蓋包含本文所述的抗CD52抗體的試劑盒(如診斷試劑盒)。
在一個實施方案中,提供檢測樣品中的人CD52的方法,該方法包括在適于抗體和人CD52特異性結合的條件下,使樣品和本發明抗體接觸,并檢測所形成的抗體CD52復合物。在該方法的應用中,本文所述的抗體可用于分析正常vs.發炎組織(如,得自人)對人CD52的反應性和/或表達(如,免疫組織學上),以檢測例如炎性腸病(IBD)、自身免疫疾病(例如多發性硬化癥和紅斑狼瘡)、癌癥(如非霍奇金氏淋巴瘤和慢性淋巴性白血病)或其他癥狀和人CD52(如,于受影響組織中)表達增加間的關系。因此,本發明抗體允許評估人CD52在正常及發炎組織中的存在的免疫方法,從而可于疾病(如,炎性疾病)的治療中,評估疾病的存在、疾病的進展和/或抗人CD52療法的效力。
此外,所述抗體可用于檢驗用消耗性抗CD52治療抗體治療后的組織,以衡量消耗的功效如何以及確定CD52的表達是否有任何下調(Rawstrom等, Br.J.Heam.,107:148-153(1999))。
除非另行限定,否則本文所用的所有技術和科學術語具有和本領域的技術人員通常了解的相同意義。下文描述了例示的方法和材料,但與本文所述類似或等同的方法和材料還可用于實施或測試本發明。本文描述的所有出版物及其他參考文獻全部內容均并入本文用于參照。沖突的情況中,以本說明書(包括限定)為準。本文中雖然引用一些文件,但引用并不構成承認任何這些文件形成本領域中一般普遍知識的一部分。在整個說明書及實施方案中,“包含”應理解為意指包括所述整數或整數結合但不排除任何其他整數或整數集合。材料、方法和實施方案僅供說明用途而并非意在限定。
下述實施例意在說明本發明的方法和材料。本領域中通常遇到的所述條件的適當修飾和改變對本領域的技術人員而言為顯而易見且屬于本發明精神和范圍內。本文中,術語“抗體”和“免疫球蛋白”可互換使用;“抗原結合片段”和“抗原結合部分”也可互換使用。
實施例
下述實施例意在說明本發明的方法和材料。本領域中通常遇到的對所述條件的適當修飾和改變對本領域的技術人員而言為顯而易見且屬于本發明精神和范圍至之內。
實施例1:抗體Ab1的表達和表征
抗體Ab1通過改變Ab26輕鏈中的殘基33(于L-CDR1之內)為Asp衍生自Ab26。此外,刪除Ab26輕鏈前33個氨基酸殘基,產生變體抗體(Del33抗體)。在輕鏈骨架中將該變體輕鏈DNA通過DNA2.0合成于pDONR221Entry載體中,隨后通過Gateway克隆,亞克隆入HEK293表達載體pCEP4(-E+I)Dest中。隨后進行大規模DNA制備以供HEK293-EBNA細胞轉染。所有變體和親源Ab26對照輕鏈和親源Ab26重鏈以1:1比例共轉染。
對于純化,使用1毫升HiTrap蛋白質A柱(GE)和多通道泵裝置,使用160-300毫升的轉染培養基純化Ab26、Del33和Ab1抗體。通過NanoDrop測量收集級分中的A280。合并含大部分蛋白質的級分#1和#2,緩沖液交換入50mM磷酸鈉、150mM氯化鈉,pH6.0,并使用10kD截留柱的Amicon-4進行濃縮。蛋白質純化產率總結于表3。
表3蛋白純化產率

Del33突變體未以高水平表達或純化,很可能是由于與缺失有關的錯誤折疊問題。Ab1和Ab26成功地純化至均質以用于進一步表征。前15個氨基酸的N端測序證實所有三個樣品具預期的序列。
Ab26和Ab1還在CHO細胞中表達并于蛋白質A柱上純化。通過BIACORETM表征所述抗體對CD52肽的親和力。HEK293細胞中產生的抗體的結果示于圖17和表4,而CHO細胞中產生的抗體的結果示于圖18和表5。
表4HEK293細胞中表達的抗體的結合親和力
抗體ka(x106M-1s-1)kd(s-1)KD(nM)Ab26(制備物1)7.20.011.7Ab26(制備物2)5.40.012.2Ab10.40.581480

表5CHO細胞中表達的抗體的結合親和力
抗體ka(x106M-1s-1)kd(s-1)KD(nM)Ab266.21.62.6Ab10.338.31250

CD52BIACORETM結合分析如下述進行:將低水平的CD52肽模擬表位(CGQNDTSQTSSPSAD(SEQIDNO:87))經由硫醇化學使用N端Cys固定于CM5芯片上。將于HBS-EP電泳緩沖液中制備的數個濃度的抗CD52抗體(1至20納摩爾)注射于表面以監測結合。使用Scrubber2軟件進行動力學分析。
相比Ab26,抗體Ab1展示親和力大于400倍的下降。Ab1抗體在1-10nM濃度未觀察到明顯的結合信號,然而Ab26展現高結合親和力(圖17)。為盡可能得到變體結合親和力喪失的定量測量,使用較高濃度的Ab1的(高達1900nM)。從CHO產生的Ab1得到的1250nMKD與HEK293產生的Ab1(1480nM)一致。親和力的減少反映在動力學結合上,既降低結合速率(on-rate)又增加解離速率(off-rate)。
通過測量經由補體依賴型細胞毒性的細胞殺傷進行CDC效力分析以評估親和力損失是否影響效應物功能。所有變體和對照抗體材料在黑色固體96 孔板上于分析培養基(不含酚紅的IMDM培養基+0.1%BSA)中,從2毫克/毫升至0.002毫克/毫升進行1:2系列稀釋。測試儲存濃度≤2毫克/毫升的材料純凈。向所有孔添加正常人血清補體(QuidelCorporation)至最終濃度為5%(v/v)。隨后添加菲佛氏(Pfeiffer)b-淋巴細胞(ATCC)至終濃度為0.6x106細胞/毫升。相同培養板上包括陰性細胞裂解對照(分析培養基+細胞)、陽性細胞裂解對照(分析培養基+細胞+2%(w/v)TritonX-100)和陽性劑量反應對照(4毫克/毫升對照材料)。反應在濕潤的37℃,5%CO2培養箱中溫育1小時。隨后向所有孔中添加50微升預溫熱的檢測試劑(LifeTechnologies),隨后在減光下溫育4小時。使用熒光板讀取計(激發:530nm,發射:590,截留:570nm)測量的相對減少。使用SoftmaxPro,v.5.3(MolecularDevices)產生擬合成四參數模型的劑量反應曲線。結果示于圖19。如所預期,Ab26(對照)展示濃度依賴性的細胞殺傷。CHO細胞中產生的抗體Ab1在所測試的濃度范圍中幾乎不展示可檢測的CDC活性。這些實驗表明單一氨基酸取代可能對Ab26的生物功能具有顯著影響。
實施方案2:抗CD52抗體的CD52結合親和力分析
抗體Ab4、Ab3、Ab24、Ab10、Ab12和Ab25(見表1和2)在HEK293細胞中表達。如下合成輕鏈DNA,亞克隆,并于HEK293細胞中瞬時表達。在輕鏈骨架中將該DNA分子通過DNA2.0合成于pDONR221Entry載體中,然后通過Geteway克隆,亞克隆入HEK293表達載體pCEP4(-E+I)Dest中。將表達輕鏈的載體和表達Ab26重鏈的載體共轉染入HEK293細胞中。使用Ab26DNA作為轉染對照。使用蛋白質A傳感器通過Octet針對蛋白質表達水平并使用CD52肽芯片通過BIACORETM針對CD52結合親和力篩選條件培養基。結果示于圖1。
Ab24和Ab10抗體展示較強的CD52結合親和力。Ab4和Ab3展示較弱的CD52結合親和力。為證實該發現,使用蛋白質A柱純化Ab4和Ab3用于進一步表征。Ab26抗體(CTL)、來自兩個轉染的Ab26抗體(CTL1和CTL2)、Ab1、Ab4、Ab3、Ab10、Ab24、Ab12和Ab25的SDS-PAGE凝膠和BIACORETMCD52肽結合結果示于圖2。
純化抗體的結果證實了初始培養基的篩選數據。Ab4和Ab3展示了較低的CD52結合親和力。
實施方案3:Ab24和Ab10抗體的大規模制備和表征
在CHOK1細胞中大規模生產了Ab24和Ab10抗體以測定其CD52的結合和抑制特性。在兩個抗體中觀察到輕鏈剪切;且在非還原性(NR)凝膠上觀察到150kD以下的條帶(此處稱為“100kD類型”)(圖3)。
通過優化的組織培養條件并省略培養基在4℃的保存步驟,可使輕鏈剪切問題盡量降低。盡管有這些改進,似乎仍有少量100kD類型(在150KD下)產生(圖3)。進一步表征這兩種抗體。通過SEC-HPLC,分別于Ab24和Ab10的兩個較大規模制備物中發現了9-12%和18-20%的100kD類型。完整的質譜實驗確認了該抗體的序列。低分子量類型的N端測序提示僅存在重鏈的N端序列。當收集100kD類型并于SDS-PAGE凝膠上分析時,僅觀察到重鏈。這些結果提示所述100kD類型僅包含重鏈(圖4)。
實施方案4:其他抗CD52抗體的制備和篩選
將抗體Ab2、Ab6、Ab7、Ab5、Ab13、Ab15、Ab17、Ab18、Ab19、Ab23、Ab22、Ab11、Ab20、Ab16、Ab21和Ab14(參見表1和2)的表達載體轉染入HEK293細胞中。在Octet上用蛋白A傳感器分析條件培養基時,所有抗體表達>0.2微克/毫升(圖5,上圖)。隨后使用這些培養基樣品的BIACORETMCD52親和力篩選以鑒定領先的候選者(圖5,中圖及下圖)。
抗體Ab2、Ab6、Ab7和Ab5對CD52的結合親和力低。幾種其他抗體展示了較高的CD52結合親和力。這些抗體包括Ab22、Ab20、Ab21、Ab14、Ab14和Ab11。對抗體Ab22、Ab20、Ab21、Ab14、Ab14和Ab11進行進一步研究。
將這六個抗體(Ab22、Ab20、Ab21、Ab14、Ab14和Ab11)擴大規模至一個TripleFlask/抗體瞬時表達。(該培養瓶具有三個平行的生長表面,以提供500cm2的總培養面積)。使用1毫升HiTrap蛋白質A親和力柱(GEHealthcare),從160毫升條件培養基純化所述抗體。還原性SDS-PAGE凝膠顯示了成功的純化和合理的抗體純度(圖6)。為了以BIACORETM進行CD52結合比較,將純化樣品在HBS-EP中稀釋至60和7.5nM,并注射于CD52肽#741芯片上(7.5nM的結果示于圖6)。該BIACORETM結合分析證實了初始培養基篩選結果,即這些抗體與CD52肽緊密結合。動力學結合實驗表明下述親和力排名:(Ab16、Ab21)>Ab26>(Ab20、Ab11、Ab14、Ab22)>(Ab24、Ab10)
Ab16和Ab21顯示具有比Ab26高的親和力。
實施方案5:抗CD52抗體的穩定性分析
為確定抗CD52抗體變體的穩定性是否已受到影響,使用高溫條件比較并篩選抗CD52抗體變體。使用Ab26和從HEK293細胞純化的選定變體進行初始篩選。在PBS(pH7.2)中將蛋白質(85微克)稀釋至約0.4毫克/毫升,在45℃溫育4周。在BIACORETM上測量其對CD52肽的結合親和力。在HBS-EP中將第2周和第4周取出的1微克每種變體系列稀釋至7.5、2.5和0.8nM,并注射于CD52肽#741芯片上。使用Scrubber軟件計算初步結合常數并示于圖20(Ab26標記為“CTL”)。
結果表示,Ab21、Ab16和Ab20抗體在4周溫育期間保留顯著的CD52結合親和力,表明它們比抗體Ab26更穩定。相比之下,Ab10和Ab22抗體在溫育時期期間喪失其對抗原的大部分結合親和力。
為了確認溫育實驗中得到的結果,生成了變體的新制備物并與Ab26抗體一起在37℃或45℃在“三組分”緩沖液(10mM琥珀酸鹽、10mM組氨酸、10mM磷酸鈉,pH7.5)中一起溫育4周。該“三組分”緩沖液通常用于抗體的可生產性測試中。溫育材料的量列于表6。Ab21、Ab16和Ab20抗體還在相同緩沖液中于45℃進行溫育。在第2周和第4周(T2和T4)取出等分試樣,通過BIACORETM評估其對CD52肽的親和力。各樣品于HBS-EP中稀釋至7.5、3.75和1.875nM,并注射于CD52肽#741芯片上達3分鐘,隨后于緩沖液中解離3分鐘。表觀KD示于圖21。
表6三組分緩沖液實驗中溫育的材料的量
突變體濃度(mg/ml)37℃溫育(μg)45℃溫育(μg)Ab200.3637575Ab220.35075-Ab160.3667575Ab210.3917575Ab140.35975-Ab240.36175-Ab100.38275-Ab110.40175-CTL10.35475-CTL20.3757575

結果提示,于37℃和45℃溫育4周后,Ab21、Ab16和Ab20抗體的結合親和力保持不變或僅略為下降,而Ab26(CTL、CTL1和CTL2)則隨時間喪失結合親和力。于45℃溫育4周后,Ab26(CTL)的KD從4.3nM變化至1230nM,表示和CD52的結合下降。這提示這些突變體于L-CDR1位點確實隨時間對經過的不穩定性更具抗性。
為了驗證Ab21、Ab16和Ab20抗體的結構完整性,通過SEC-HPLC評估于PBS(pH7.2)中稀釋至約0.4毫克/毫升并于45℃溫育4周的變體的聚集和斷裂。于移動相(40mM磷酸鈉、500mM氯化鈉,pH6.0)中,稀釋5微克的蛋白質至總體積為100微升,然后以0.5毫升/分鐘注入TSKGelG3000SWxl柱上,為時35分鐘。于Ab21、Ab16、Ab20和Ab26(CTL)中,無明顯的聚集及有限的斷裂被檢測出(圖22)。因此,Ab26親和力的喪失可能不是由于結構完整性的喪失所引起。
實施例6:抗CD52抗體于體外效力分析(CDC效力)中的生物活性
于CDC分析中,評估了三個抗CD52抗體(Ab21、Ab20和Ab16)。使用此分析法測量所述抗體于補體存在下分解菲佛氏B-淋巴細胞的能力。抗體于相同平板上以單次分析(singlicate)并和Ab26(對照)進行定性比較(參見,圖7)。
結果顯示Ab21和Ab16的效力可與Ab26相當或更為改善。Ab20于此測試中具略低的效力。
實施例7:抗CD52抗體于HuCD52轉基因小鼠中的生物活性
還于huCD52轉基因小鼠中體內評估了3個抗CD52抗體(Ab21、Ab20和Ab16)。對HuCD52轉基因小鼠靜脈內注射1毫克/千克的Ab26、Ab21、Ab20或Ab16(5只動物/組)。注射后第3天,利用流式細胞測量術分析血液和脾臟的淋巴細胞消耗。通過流式細胞測量術分析的血液和脾臟中的淋巴細胞消耗程度示于圖8(Ab26標識為“CTL”)。
結果提示,由抗體Ab21、Ab20和Ab16于血液和脾臟中所誘發的淋巴細胞消耗似乎和抗體Ab26相似或更為改善。綜上所述,這些數據證實這些抗CD52抗體具體內生物活性。
表7列出本文使用的SEQIDNO。
表7SEQIDNO





























































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