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乙肝病毒基因的小干擾核糖核酸序列及制備方法.pdf

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乙肝病毒 基因 干擾 核糖核酸 序列 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN200410089359.7

申請日:

2004.12.07

公開號:

CN1648250A

公開日:

2005.08.03

當前法律狀態:

終止

有效性:

無權

法律詳情: 未繳年費專利權終止IPC(主分類):C12N 15/11申請日:20041207授權公告日:20070425終止日期:20100107|||授權|||實質審查的生效|||公開
IPC分類號: C12N15/11; C12N15/10; C12N15/51; A61K48/00; A61P1/16 主分類號: C12N15/11; C12N15/10; C12N15/51; A61K48/00; A61P1/16
申請人: 浙江大學;
發明人: 朱海紅; 陳智
地址: 310027浙江省杭州市西湖區浙大路38號
優先權:
專利代理機構: 杭州求是專利事務所有限公司 代理人: 趙杭麗;張法高
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200410089359.7

授權公告號:

|||1312283||||||

法律狀態公告日:

2011.02.23|||2007.04.25|||2005.09.28|||2005.08.03

法律狀態類型:

專利權的終止|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供乙肝病毒(HBV)基因的小干擾核糖核酸(siRNA)序列及制備方法,SEQID NO.1-4為本發明提供的轉錄siRNA的2對針對HBV(ayw亞型)S基因的DNA模板序列,用體外轉錄方法合成針對HBV(ayw亞型)基因的特異siRNA,經轉染細胞后,達到抑制HBV基因表達的目的。該方法可快速、經濟、較大量地獲得抗HBV的siRNA,為抗HBV的實驗研究和臨床應用提供技術和大量siRNA。

權利要求書

1: 乙肝病毒基因的小干擾核糖核酸序列,其特征是:SEQ?ID?NO.1-4為轉 錄siRNA的2對針對乙肝病毒基因的DNA模板序列: SEQ?ID?NO.1??5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGCCCTGTCTC-3’ SEQ?ID?NO.2??5’-AAGCAATTTCCGTCCGAAGGTCCTGTCTC-3’ SEQ?ID?NO.3??5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTCCCTGTCTC-3’ SEQ?ID?NO.4??5’-AAGAGTCTAGACTCTGCGGTACCTGTCTC-3’。
2: 根據權利要求1所述的乙肝病毒基因的小干擾核糖核酸序列的制備方 法,其特征是通過以下步驟實現: (1)siRNA的設計, (2)特異性siRNA的轉錄模板的設計和合成, (3)退火, (4)補平, (5)轉錄, (6)模板降解, (7)過柱純化。
3: 根據權利要求2所述的制備方法,其中步驟(1)選取針對乙肝病毒ayw 亞型S基因的2條siRNA的目標cDNA靶序列,序列如下: 5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGC-3’ 5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTC-3’。
4: 根據權利要求2所述的制備方法,其中步驟(2)設計并合成兩段29-mer 的DNA作為模板,包括8個與T7啟動子引物3’端匹配的堿基和21個設計的 siRNA序列。
5: 根據權利要求2所述的制備方法,其中步驟(3)將這兩個模板和對應 的T7啟動子引物分別混合,引物末端和DNA模板退火結合。
6: 根據權利要求2所述的制備方法,其中步驟(4)用DNA聚合酶Klenow 大片斷補平成為雙鏈DNA模板。
7: 根據權利要求2所述的制備方法,其中步驟(5)分別用T7?RNA聚合 酶進行體外轉錄,將產物混合形成dsRNA,新的雙鏈RNA包含5’端單鏈的引導 序列和中間互補的19個堿基序列以及3’端兩個重復的U。
8: 根據權利要求2所述的制備方法,其中步驟(6)通過DNA酶降解模 板,同時用單鏈專一的核酸酶消化5′的引導序列,由于RNase不能切開U堿 基也不能切雙鏈RNA,所以得到的產物就是我們需要的21-mer的雙鏈 siRNAs——有19個堿基互補,3′端各有2個U突出。
9: 根據權利要求2所述的制備方法,其中步驟(7)通過試劑盒提供的純 化小柱,去除引物、堿基鹽和蛋白質等雜質,得到siRNAs。
10: 根據權利要求1所述的乙肝病毒基因的小干擾核糖核酸序列,在制備 抑制乙肝病毒基因表達藥物中的應用。

說明書


乙肝病毒基因的小干擾核糖核酸序列及制備方法

    【技術領域】

    本發明屬于生物技術,涉及基因工程技術領域,具體地說涉及針對乙肝病毒基因的小干擾核糖核酸序列及制備方法。

    背景技術

    (1)乙肝病毒(HBV)的治療現狀

    慢性乙型肝炎是我國的高發疾病之一,是導致肝纖維化和肝癌的主要原因。目前治療乙型肝炎的藥物主要是以α干擾素為主的免疫調節劑和以拉米呋啶、阿德福韋為主的核苷類似物,但治療效果仍不滿意。HBV?DNA的持續復制是導致乙型肝炎慢性化的主要原因。因此有效抑制HBV?DNA復制,是治療慢性乙型肝炎和控制HBV持續感染的關鍵。

    (2)RNA干擾的現狀

    最近,RNA干擾(RNA?interference,RNAi)技術的出現,給抗病毒疾病的治療注入了新的活力。幾十年來,RNA被認為僅僅是從DNA獲取遺傳信息,并將信息傳遞給蛋白質。但最近研究發現,小片段RNA(small?RNA)發揮著基因調控的作用,它能關閉基因的表達,或改變基因表達的水平[1]。現實驗研究已經證實在哺乳動物細胞中,21-23個核苷酸長度的雙鏈RNA(double-stranded?RNA,dsRNA),可有效降解特定地RNA,從而阻斷蛋白質的表達[2,3],這些特定長度的dsRNA被稱為siRNA(small?interfering?RNAs)。進一步的機理研究發現,siRNA不僅能夠在轉錄后水平沉默(transcriptionalgene?silencing?PTGS)特定基因的功能,還能在DNA和轉錄水平調節基因(transcriptional?gene?silencing,TGS)的表達[4]。現研究主要集中在轉錄后水平,siRNAs在細胞漿中形成后首先進入RISC復合體(RNA?induced?silencingcomplex),在ATP和解旋酶等的作用下解旋成單鏈,反義鏈通過堿基互補方式結合到特定序列的RNA上,在RISC復合體的協助下切割特定RNA序列,從而降解RNA,使之無法翻譯成蛋白質,造成該特定基因沉默(gene?silencing),失去功能[4]。同時,RNAi具有高度特異性,19對核苷酸的雙鏈RNA(其3’端外掛2個脲嘧啶序列[5])幾乎可以完全抑制基因的表達,而將其中的一個核苷酸突變掉后,它對基因的抑制作用就消失了,這對siRNA的應用是非常重要的,可以避免siRNA降解與靶mRNA同家族的其他的mRNA[5]。此外,已有研究發現,RNAi除了在轉錄后水平調節基因表達,而且能使同源DNA序列甲基化結構,因而在轉錄水平具有重要的調控作用,Mette等證實與NOSPro基因啟動子區同源的23nt的dsRNA可直接引起目的基因的DNA序列的甲基化,導致轉錄失活[6]。

    RNAi作為一種RNA基礎上的細胞“免疫”系統,近來被應用于抗病毒感染和復制的研究中,并在HIV的體外實驗中取得了較理想的結果,作用強度遠遠超過了反義核酸和核酶技術[7]。Rossi等將HIV-1編碼rev的基因和與它同源的雙鏈RNA共轉染到293細胞中,rev基因的表達被顯著抑制;同時將siRNA的抑制效應與反義RNA,核酶等進行了比較,發現只有siRNA組抑制了HIVrev-EGFP的表達,其抑制率達到90%,而反義RNA,核酶組與對照組無顯著差異[7],這一結果同樣被Sharp等學者所證實[8]。在針對肝炎病毒基因的RNAi研究中,已有研究表明:針對HCV基因靶序列的siRNA能有效抑制HCV?RNA的復制及病毒蛋白的表達[10]。由于RNA干擾采用的是雙鏈RNA,它比較穩定,不易被降解,因此RNA干擾不僅在體外,而且在動物體內亦具有較好的效果。因此,RNAi現象的發現,被《SCIENCE》雜志和美國科學促進會評為2002年十大科學成就之一,具有廣闊的應用前景。現今一致認為針對病毒基因的siRNA是最佳的治療策略[9]。

    (3)RNA干擾的5種方法

    目前,用于RNA干擾的方法主要有5種:(1)化學合成法:直接通過化學方法合成dsRNA,其優點是快速、合成量較大,但是價格昂貴;(2)體外轉錄法:以Oligo?DNA為模板,通過體外轉錄合成siRNAs,成本相對化學合成而言比較低,而且能夠比化學合成法更快得到siRNAs。值得一提的是體外轉錄得到的siRNAs毒性小,穩定性好,效率高,一般只需化學合成的siRNA量的1/10就可以達到同等的效果。但技術難度較大;(3)RNaseIII降解dsRNA法:將200~1000個堿基的靶mRNA用體外轉錄的方法制備后,然后用RNaseIII在體外消化,得到有多種siRNA的混合物,其優點是可以快速而經濟地研究某個基因功能缺失的表型,但是不適合長時間的研究項目,或者是需要一個特定的siRNA進行研究,特別是基因治療;(4)siRNA表達載體法:構建表達特異性siRNA的載體,導入真核細胞內表達siRNA,具有可以大量擴增的優點,但是存在基因整合的潛在危險;(5)siRNA表達框架(siRNA?expressioncassettes)法:直接通過PCR方法得到表達siRNA的DNA模板,導入真核細胞后在體內轉錄成siRNA,其優點是方法簡單、速度快,可用于篩選有效siRNA序列,但是也存在基因整合的潛在危險。

    縱觀上述5種方法的優缺點,和RNA干擾應用在慢性HBV感染的實驗研究和臨床應用中的前景,本發明選擇體外轉錄法合成特定靶序列的dsRNA。

    【發明內容】

    本發明提供乙肝病毒(HBV)基因的小干擾核糖核酸(siRNA)序列及制備方法,SEQ?ID?NO.1-4為本發明提供的轉錄siRNA的2對針對HBV(ayw亞型)S基因的DNA模板序列,用體外轉錄方法合成針對HBV(ayw亞型)基因的特異siRNA,經轉染細胞后,達到抑制HBV基因表達的目的。該方法可快速、經濟、較大量地獲得抗HBV的siRNA,為抗HBV的實驗研究和臨床應用提供技術和大量siRNA。

    本發明提供轉錄siRNA的2對針對HBV(ayw亞型)S基因的DNA模板序列:

    SEQ?ID?NO.1(Antisense?anti-s?siRNA1?Oligonucleotide?template)

    ???????5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGCCCTGTCTC-3’

    SEQ?ID?NO.2(Sense?anti-s?siRNA1?Oligonucleotide?template)

    ???????5’-AAGCAATTTCCGTCCGAAGGTCCTGTCTC-3’

    SEQ?ID?NO.3(Antisense?anti-s?siRNA2?Oligonucleotide?template)

    ????????5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTCCCTGTCTC-3’

    SEQ?ID?NO.4(Sense?anti-s?siRNA2?Oligonucleotide?template)

    ????????5’-AAGAGTCTAGACTCTGCGGTACCTGTCTC-3’本發明的2對針對HBV(ayw亞型)S基因的DNA模板序列通過以下步驟實現:

    (1)siRNA的設計

    (2)特異性siRNA的轉錄模板的設計和合成

    (3)退火

    (4)補平

    (5)轉錄

    (6)模板降解

    (7)過柱純化

    【具體實施方式】

    本發明結合實施例作進一步說明。

    實施例一????體外轉錄合成干擾RNA體外抑制HBV表面抗原融合基因的表達

    siRNA的制備

    (1)siRNA的設計??根據siRNA的設計原理并利用直接合成siRNA的實驗結果,選取針對HBV(ayw亞型)S基因的2條siRNA的目標cDNA靶序列。序列如下:

    (anti-s?siRNA1)5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGC-3’

    (anti-s?siRNA2)5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTC-3’

    (2)特異性siRNA的轉錄模板的設計和合成根據上述的cDNA靶序列,設計并合成兩段29-mer的DNA作為模板,包括8個與T7啟動子引物3’端匹配的堿基(稱為引導序列,leader?sequence)和21個設計的siRNA序列。

    ①特異性anti-s?siRNA1的反義鏈和正義鏈如下:

    Antisense?anti-s?siRNA1?Oligonucleotide?template

    5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGCCCTGTCTC-3’

    Sense?anti-s?siRNA1?Oligonucleotide?template

    5’-AAGCAATTTCCGTCCGAAGGTCCTGTCTC-3’

    ②特異性anti-s?siRNA2的反義鏈和正義鏈如下:

    Antisense?anti-s?siRNA2?Oligonucleotide?template

    5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTCCCTGTCTC-3’

    Sense?anti-s?siRNA2?Oligonucleotide?template

    5’-AAGAGTCTAGACTCTGCGGTACCTGTCTC-3’

    (3)退火將這兩個模板和對應的T7啟動子引物分別混合,引物末端和DNA模板退火結合。

    2μl?T7?promoter?primer

    6μl?DNA?Hyb?buffer

    2μl正義或反義的模板

    70℃,5min→room?temp,5min

    (4)補平??用DNA聚合酶Klenow大片斷補平成為雙鏈DNA模板。

    在上述反應管中加入:

    2μl?10×Klenow?Reaction?buffer

    2μl?10×dNTP?Mix

    4μl?Nuclease-free?water

    2μl?Exo-klenow

    輕柔混勻,37℃,30min;

    (5)轉錄??分別用T7?RNA聚合酶進行體外轉錄,將產物混合形成dsRNA,新的雙鏈RNA包含5’端單鏈的引導序列和中間互補的19個堿基序列以及3’端兩個重復的U(UU)。

    每個轉錄反應管中加入:

    2μl?正義或反義siRNA模板

    4μl?Nuclease-free?water

    10μl?2×NTP?Mix

    2μl?10×T7?Reaction?buffer

    2μl?T7?Enzyme?Mix

    輕柔混勻,37℃,2hr;

    正義和反義轉錄產物混合,置于37℃過夜

    (6)模板降解??通過DNA酶降解模板,同時用單鏈專一的核酸酶消化5′的引導序列,由于RNase不能切開U堿基也不能切雙鏈RNA,所以得到的產物就是我們需要的21-mer的雙鏈siRNAs——有19個堿基互補,3′端各有2個U突出。

    上述反應物中加入:

    6μl?Digestion?buffer

    48.5μl?Nuclease-free?water

    3μl?RNase

    2.5μl?DNase

    混勻后,37℃,2hr;

    (7)過柱純化??通過試劑盒提供的純化小柱,去除引物、堿基鹽和蛋白質等雜質,得到的就是可以立即轉化用的siRNAs,按說明書進行。

    實施例2?anti-s?siRNA抑制報告質粒pGFP-S和siRNA共轉染HepG2細胞的綠熒光蛋白表達和HBV?S基因表達的實驗

    (1)報告質粒pGFP-S和siRNA共轉染HepG2細胞??報告質粒pGFP-S是表達報告基因綠熒光蛋白和HBsAg融合蛋白的質粒。HepG2細胞按照1×105/孔接種24孔板,培養24小時后達到80%-90%融合率,共轉染pGFP-S和siRNA,具體步驟參照Invitrogen公司Lipofectamine2000說明書。6小時后換10%FCS?DMEM,同時設置只轉染pGFP-S載體的陰性組,每組重復3孔。

    (2)熒光顯微鏡觀察細胞綠熒光蛋白表達??轉染48小時后,在倒置熒光顯微鏡(DM?IRB,Leica)下觀察綠熒光蛋白在HepG2細胞中的表達情況。結果顯示,與pGFP-S載體的陰性組相比,轉染pGFP-S和anti-S?siRNA的HepG2細胞的熒光強度減弱,熒光細胞數減少。

    (3)流式細胞儀觀察細胞綠熒光蛋白表達??轉染48小時后,常規消化HepG2細胞,離心懸液,重懸于PBS,流式細胞儀檢測表達熒光蛋白的陽性細胞數比例和平均熒光強度。結果顯示,與pGFP-S載體的陰性組相比,轉染pGFP-S和siRNA的HepG2的陽性細胞數比例降低,平均熒光強度降低。

    (4)逆轉錄-實時熒光定量PCR法檢測HBV?S基因RNA的表達RNA準備:轉染72小時后,收獲HepG2細胞,Trizol法抽提RNA,方法參照Invitrogen公司說明書。逆轉錄,過程參照MBI操作說明書。熒光染料法定量PCR,上游引物:5′-CTCACAATACCGCAGAGTC-3′;下游引物:5′-TAAACTGAGCCAGGAGAAA-3′;內參照GAPDH,上游引物:5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3′,下游引物:5′-GCAACAATATCCACTTTACCAGAG-3'.PCR條件為:95℃3min,再94℃30s,56℃?30s,72℃?45s,25個循環,熒光檢測點選擇72℃。同時做陽性對照(直接以pGFP-S質粒DNA為模板組)和陰性對照(不加模板組)。實時定量PCR在25循環定點檢測顯示,與陰性對照相比,anti-S?siRNA1和anti-SsiRNA2對S基因的抑制率均達到50%以上。

    實施例3?anti-s?siRNA抑制對siRNA轉染HepG2.2.15細胞的HBsAg和HbeAg表達的實驗

    (1)siRNA轉染HepG2.2.15細胞HepG2.2.15細胞按照1×104接種24孔板,培養24小時后達到30%-40%融合率,轉染siRNA各0.84μg,具體步驟參見Invitrogen公司OLIGOFECTAMINE試劑說明書。設置無關對照siGFP組(FEBS?Letters?543(2003)51-54):sense?RNA?5-GGCUACGUCCAGGAGCGCACC-3,anti-sense?RNA?5-UGCGCUCCUGGACGUAGCCTT-3。6小時后換10%FCS?DMEM。每組設3個復孔。

    (2)放射免疫法檢測HBsAg和HBeAg濃度變化轉染HepG2.2.15細胞后第48h,分別收集細胞培養液,離心去除細胞碎片,上清進行放射免疫法檢測,檢測方法參見試劑盒說明。轉染anti-S?siRNA1和anti-S?siRNA2后,HepG2.2.15細胞上清中的HBsAg和HBeAg的濃度較HepG2.2.15細胞低,anti-SsiRNA1和anti-S?siRNA2對HBsAg和HBeAg的抑制率均達到60%以上。

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