• / 46
  • 下載費用:30 金幣  

水果多酚及其生產方法以及其用途.pdf

摘要
申請專利號:

CN94115048.8

申請日:

1994.08.18

公開號:

CN1121924A

公開日:

1996.05.08

當前法律狀態:

終止

有效性:

無權

法律詳情: 專利權有效期屆滿IPC(主分類):C07G 17/00申請日:19940818授權公告日:20000405期滿終止日期:20140818|||專利權人的姓名或者名稱、地址的變更IPC(主分類):C07G 17/00變更事項:專利權人變更前:朝日啤酒株式會社變更后:朝日集團控股株式會社變更事項:地址變更前:日本東京都變更后:日本東京都|||專利申請權、專利權的轉移(專利權的轉移)變更項目:專利權人變更前權利人:日加威士己株式會社 地址: 日本東京變更后權利人:朝日啤酒株式會社 地址: 日本東京都登記生效日:2008.4.18|||專利實施許可合同的備案合同備案號: 041000030005讓與人: 日加威士己株式會社受讓人: 北京綠色金可生物技術股份有限公司發明名稱: 水果多酚及其生產方法以及其用途申請日: 1994-08-18授權公告日: 2000-04-05許可種類: 普通許可備案日期: 2004年2月9日合同履行期限: 合同期合同變更|||專利實施許可合同的備案合同備案號: 200210144讓與人: 日加威士已株式會社受讓人: 北京綠色金可生物技術股份有限公司發明名稱: 水果多酚及其生產方法以及其用途申請日: 1994.8.18授權公告日: 2000.4.5許可種類: 普通備案日期: 2002.10.31合同履行期限: 試制品的制造全部完成,日加無償提供給北京金可的原料果汁無殘存之日起終止合同變更|||授權||||||公開
IPC分類號: C07G17/00; A61K47/46 主分類號: C07G17/00; A61K47/46
申請人: 日加威士己株式會社;
發明人: 田邊正行; 神田智正; 柳田顯郎
地址: 日本東京
優先權: 1993.12.06 JP 305632/93; 1994.02.22 JP 24435/94
專利代理機構: 中國專利代理(香港)有限公司 代理人: 譚明勝;姜建成
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN94115048.8

授權公告號:

|||||||||||||||1051089||||||

法律狀態公告日:

2014.09.17|||2012.06.27|||2008.05.28|||2004.04.21|||2003.03.05|||2000.04.05|||1996.11.27|||1996.05.08

法律狀態類型:

專利權的終止|||專利權人的姓名或者名稱、地址的變更|||專利申請權、專利權的轉移(專利權的轉移)|||專利實施許可合同的備案|||專利實施許可合同的備案|||授權|||實質審查請求的生效|||公開

摘要

本發明提供了通過壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實,然后純化所得的果汁或提取物而得到的水果多酚。本發明還提供了各自包含以經壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實,然后純化所得的果汁或提取物而得到的水果多酚作為有效組分的抗氧化劑、降血壓藥劑、抗誘變劑、抗變態反應藥劑和防齲藥劑。本發明的水果多酚具有各種生理學活性,如抗氧化活性、ACE抑制活性、抗誘變活性、透明質酸酶抑制活性及GTase抑制活性。

權利要求書

1: 一種經壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實,然后純化所得 的果汁或提取物而得到的水果多酚。
2: 根據權利要求1的水果多酚,其中薔薇科的未成熟果實是蘋 果、梨或桃。
3: 一種生產水果多酚的方法,該方法包含壓榨和/或提取薔薇 科的未成熟果實,然后純化所得的果汁或提取物以得到多酚部分。
4: 根據權利要求3的方法,其中薔薇科的未成熟果實是蘋果、 梨或桃。
5: 一種抗氧化劑,它包含作為有效組分的通過壓榨和/或提取 薔薇科的未成熟果實,然后純化所得的果汁或提取物而得到的水果多 酚。
6: 根據權利要求5的抗氧化劑,其中薔薇科的未成熟果實是蘋 果、梨或桃。
7: 一種降血壓藥劑,它包含作為有效組分的具有血管緊張肽轉 化酶I抑制活性的水果多酚,該多酚是通過壓榨和/或提取薔薇科的 未成熟果實,然后純化所得的果汁或提取物而得到的。
8: 根據權利要求7的降血壓藥劑,其中薔薇科的未成熟果實是 蘋果、梨或桃。
9: 一種抗誘變劑,它包含作為有效組分的具有突變抑制活性的 水果多酚,該多酚是通過壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實,然后 純化所得的果汁或提取物而得到的。
10: 根據權利要求9的抗誘變劑,其中薔薇科的未成熟果實為 蘋果、梨或桃。
11: 一種抗變態反應藥劑,它包含作為有效組分的具有透明質 酸酶抑制活性的水果多酚,該多酚是通過壓榨和/或提取薔薇科的 未成熟果實,然后純化所得的果汁或提取物而得到的。
12: 根據權利要求11的抗變態反應藥劑,其中薔薇科的未成 熟果實為蘋果、梨或桃。
13: 一種防齲藥劑,它包含作為有效組分的具有葡萄糖基轉移 酶抑制活性的水果多酚,該多酚是通過壓榨和/或提取薔薇科的未成 熟果實,然后純化所得的果汁或提取物而得到的。
14: 根據權利要求13的防齲藥劑,其中薔薇科的未成熟果實 為蘋果、梨或桃。

說明書


水果多酚及其生產方法以及其用途

    本發明涉及水果多酚;其生產方法;和各自包含所述多酚作為有效組分的抗氧化劑、降血壓藥劑、抗誘變劑、抗變態反應藥劑和防齲藥劑。

    在結出可食用果實如蘋果、梨、桃等的薔薇科樹木的生長過程中,通常在五月中旬到七月中旬時,要進行多余果實的“蔬果”。在該蔬果時,除去成串或成簇的未成熟果實,而將其中的一部分留下。結果,大量未成熟果實經蔬果被處理掉而未被利用。這些未成熟果實與成熟果實相比非常苦,且每個未成熟果實的斷面表面容易變成褐色。這種事實表明未成熟果實中存在大量的多酚化合物。

    已經知道多酚化合物作為植物的次級代謝產物以眾多的種類和巨大的數量存在于植物界。其中的某些多酚化合物因其多種多樣的生理學活性,自過去在藥物學領域到近年的食品化學領域均引起人們的關注。

    其中,茶多酚(兒茶素類)特別引起注意并正在對其進行集中的研究。人們認識到這種茶多酚具有很廣泛的生理學活性如抗菌活性、抗病毒活性、抗氧化活性、抗誘變活性、抗癌活性、抑制血小板凝結的活性、抑制血壓升高的活性、抑制血糖升高的活性、降低血液膽固醇的活性、防齲活性、抗變態反應活性、改善腸內菌叢的活性、除臭活性等(日本專利申請公開Nos.214183/1988,6499/1990,178320/1992等)。

    因此,已知例如從茶葉中提取地多酚具有廣泛的生理學活性。

    本發明的一個目的是提供具有各種生理學活性并不同于從茶葉中提取的多酚的水果多酚。

    本發明的另一目的是提供有效且經濟地生產上述水果多酚的方法。

    根據本發明,提供了經壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實,特別是未成熟蘋果、未成熟梨或未成熟桃,然后純化所得的果汁或提取物而得到的水果多酚。

    根據本發明,還提供了生產水果多酚的方法,包括,壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實,特別是未成熟的蘋果、未成熟梨或未成熟的桃,然后純化所得的果汁或提取物以得到多酚部分。

    根據本發明,還提供了一種包含通過壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實,特別是未成熟蘋果、未成熟梨或未成熟的桃,然后純化所得的果汁或提取物而得到的水果多酚作為有效組分的抗氧化劑。

    根據本發明,還提供了一種包含以具有血管緊張肽轉化酶I抑制活性的水果多酚作為有效組分的降血壓藥劑,所述多酚是經壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實,特別是未成熟蘋果、未成熟的梨或未成熟的桃,然后純化所得的果汁或提取物而得到的。

    根據本發明,還提供了一種包含以具有能夠抑制致癌物質的誘變性的活性的水果多酚作為有效組分的抗誘變劑,所述多酚是經壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實,特別是未成熟的蘋果、未成熟的梨或未成熟的桃,然后純化所得的果汁或提取物而得到的。

    根據本發明,還提供了一種包含以具有透明質酸酶抑制活性的水果多酚作為有效組分的抗變態反應藥劑,所述多酚是經壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實,特別是未成熟的蘋果、未成熟的梨或未成熟的桃,然后純化所得的果汁或提取物而得到的。

    根據本發明,還提供了一種包含以具有葡萄糖基轉移酶抑制活性的水果多酚作為有效組分的防齲藥劑,所述多酚是經壓榨和/或提取薔薇科的未成熟果實,特別是未成熟蘋果、未成熟梨或未成熟桃,然后純化所得的果汁或提取物而得到的。

    圖1是表示HPLC色譜和未成熟蘋果多酚各峰的UV光譜比較圖。

    圖2是分別表示將所述提取物加至反應系統中的一個星期之后,形成的過氧化類脂(peroxylipid)的量(在500nm處的吸收度)與未成熟或成熟“富士”(Fuji)蘋果提取物的加入濃度之間的關系圖。

    圖3是分別表示在將所述多酚部分加至反應系統中的一個星期后,形成的過氧化類脂的量(在500nm處的吸收度)與未成熟或成熟“富士”蘋果的多酚部分的加入濃度之間的關系圖。

    圖4是表示在將各種多酚化合物分別加至各反應系統中的一個星期后,形成的過氧化類脂類的量(在500nm處的吸收度)。

    圖5是分別表示在將所述多酚部分加至反應系統一個星期后,形成的過氧化類脂的量(在500nm處的吸收度)與每種未成熟蘋果的多酚部分的加入濃度之間的關系圖。

    圖6是分別表示在將所述多酚部分加至反應系統一個星期后,形成的過氧化類脂的量(在500nm處的吸收度)與每種未成熟果實的多酚部分的加入濃度之間的關系圖。

    圖7是分別表示未成熟或成熟“富士”蘋果多酚部分的血管緊張肽轉化酶I(下文稱為ACE)抑制活性圖。

    圖8是表示以各種數量將每種多酚部分B加至反應系統后,各種多酚部分B的ACE抑制活性圖。

    圖9是表示以各種數量將每種多酚化合物加至反應系統后,各種多酚化合物的ACE抑制活性圖。

    圖10是表示用分光光度計測量的,所分離多酚部分的吸收光譜圖。

    圖11是表示縮合鞣質分子量的GPC測量結果圖。

    圖12是本發明水果多酚所含的ACE抑制物質的結構式。

    圖13是表示各種多酚對Trp-P-2的抗誘變活性圖。

    圖14是表示蘋果鞣酸和棓酸表棓兒茶素對苯并[a]芘的抗誘變活性圖。

    圖15是表示各種水果提取物的透明質酸酶抑制活性圖。

    圖16是表示抗變態反應藥劑(色甘酸鈉)和蘋果鞣酸的透明質酸酶抑制活性圖。

    圖17是表示當將各種水果多酚部分分別加至各反應系統后,形成的不可溶葡聚糖的量與加入的水果多酚部分的量之間的關系圖。

    圖18是表示當將各種多酚化合物加至各反應系統后,形成的不可溶葡聚糖的量與加入的多酚化合物的量之間的關系圖。

    根據本發明的水果多酚是一種經壓榨或提取薔薇科的未成熟果實,特別是未成熟蘋果、未成熟梨或未成熟桃,然后將所得的果汁或提取物純化而得到的多酚。純化的進行是通過用吸附劑處理果汁或提取物,由吸附劑所吸附的果汁或提取物部分(下文將該部分稱為“吸附部分”)含有水果多酚。用無水醇(如乙醇)洗脫吸附部分,從而得到純化的多酚部分。

    然后將該多酚部分濃縮,從而可得到液體的多酚產物。

    若使上述得到的濃縮物經噴霧干燥或冷凍干燥,則可得到粉末狀多酚產物。

    本發明中所用的起始材料是薔薇科的果實。具體地講,蘋果、梨、桃等是優選的,而蘋果是特別優選的。所述果實可以是成熟或未成熟的,但未成熟果實是特別優選的,因為它們含有較大總量的多酚化合物,也因為它們含有大量具有各種生理學活性的各種多酚化合物。

    下面針對壓榨方法進行描述。在一種壓榨方法中,先洗滌起始材料;然后在加入或不加入亞硫酸的情況下,壓碎并壓榨洗滌過的材料,得到果汁;優選的是,向其中加入果膠溶解酶;然后使所得的混合物經離心、過濾等以得到澄清的果汁。

    下面描述提取方法。在一種提取方法中,將洗滌過的材料與醇(如乙醇或甲醇)混合;將混合物壓碎;將所得材料浸漬并壓榨,或回流,以對其進行提取;將提取物減壓濃縮以除去醇;然后將濃縮物離心并過濾,或者用有機溶劑(如己烷或氯仿)分配并過濾以得到澄清的提取物。

    下面描述純化上面得到的果汁或提取物的方法。使上面得到的澄清果汁或澄清提取物通過裝有吸附劑的柱子,由此吸附劑吸附多酚部分,所述吸附劑能選擇性地吸附所述果汁或提取物中所含的水果多酚,并且通過洗脫劑的使用能釋放所吸附的多酚。[吸附劑的實例是苯乙烯-二乙烯基苯型的合成樹脂、陰離子交換樹脂和十八烷基-化學鍵合的硅膠(ODS)]。然后使蒸餾水通過該柱進行洗滌,然后使20-100%醇(如乙醇)溶液,優選約50%醇溶液通過該柱,由此洗脫并回收多酚部分。減壓濃縮所得的多酚溶液以除去醇,由此可得到水果多酚的液體產物(優選向其中加入有機酸如蘋果酸等)。在加入或不加入粉化輔助劑如糊精等的情況下,使該液體產物經噴霧干燥或冷凍干燥,由此可得水果多酚的粉末產品。

    由本發明人證實,本發明得到的水果多酚絕大多數由(1)簡單的多酚化合物如咖啡酸衍生物、對香豆酸衍生物、黃烷-3-醇類(兒茶素類)、黃酮醇類(五羥黃酮苷類)、二氫查耳酮類(根皮素苷類)等和(2)高分子多酚化合物如縮合鞣質等組成。

    因此,認為本發明中得到的水果多酚具有各種生理學功能,本發明人已進行了廣泛的研究。結果,首先發現,本發明的水果多酚含有大量能抑制亞油酸(一種植物油)氧化的成分。因此,本發明的水果多酚作為一種抗氧化劑是非常有效的。

    接著發現,本發明的水果多酚含有大量能抑制ACE(這是一種與血壓升高有關的酶)功能的成分。因此,本發明的水果多酚作為降血壓藥劑也是非常有效的。

    進行了進一步的研究以鑒定本發明水果多酚中所含的ACE抑制成分。結果證實,ACE抑制成分是由圖12所示的結構式所代表的縮合鞣質。

    近年來進行的許多研究表明,致癌物質和誘變物質之間有密切的聯系,因此,致癌性和誘變性之間有密不可分的聯系。因而,期望能抑制誘變性的物質能夠預防致癌性。本發明人對本發明水果多酚是否具有抗誘變活性作了檢測,證明該多酚有所述活性。因此,本發明的水果多酚作為抗誘變藥劑是非常有效的。

    透明質酸酶是一種被認為在結締組織重建中表現出某種細胞活性的酶。近年來完成的研究(Chem.Pharm.Bull.,33,p.642,1985;ibid.,33,p.5079,1985;ibid.,33,p.3787,1985;ibid.,33,p.5079,1985;和ibid.,40,p.1439,1992)表明,在合成的抗變態反應藥劑(如,色甘酸鈉和tranilast)中,透明質酸酶抑制活性與抑制組胺從肥大細胞中釋放的活性之間有密切的聯系。利用這種聯系,通過檢測天然產物的透明質酸酶抑制活性而在所述產物中發現了數種抗變態反應物質。因此,本發明人對本發明的水果多酚是否具有透明質酸酶抑制活性作了檢測,確證,該多酚具有此活性。因此,本發明的水果多酚作為抗變態反應藥劑也是很有效的。

    目前已證實,齲齒(被腐蝕的牙)是由口腔鏈球菌屬包括鏈球菌突變體引起的與細菌有關的疾病。在齲齒的發展過程中,認為沉積物的形成是特別重要的因素。

    這就是說由葡萄糖基轉移酶(下文稱之為“GTase”)(該酶是一種由生齲菌產生的酶)的作用從食物中所含的蔗糖合成了粘性的且不可溶的葡聚糖;細菌經所述的葡聚糖粘附在牙本質上;所產生的沉積物引起齲齒。

    因此,期望能夠抑制GTase作用的物質可作為有效的防齲藥劑[Appl.Env.Microbiol.,59(4),pp.968-973,1993;Biosci.Biotech.Biochem.,56(5),pp.766-768,1992;Agric.Biol.Chem.,54(11);pp.2925-2929,1990;和Chem.Pharm.Bull.,38(3),pp,717-720,1990]。

    因此,本發明人對于本發明的水果多酚是否具有對由S.sobrinus(典型的生齲菌)產生的產生不可溶的葡聚糖的GTase的抑制活性作了檢測,發現所述多酚有此活性。因此,本發明的水果多酚作為一種防齲劑也是很有效的。

    下面,用更詳細的有關實施例描述本發明。然而,本發明并不限于這些實施例。實施例1未成熟的蘋果汁的組分分析

    使下列樣品進行常規的組分分析。

    樣品:

    成熟的“富士”蘋果:不用口袋生長的市售產品。

    未成熟的“富士”蘋果:在六月中旬采摘的

    樣品的處理:

    用混合器將每種水果樣品壓碎,加入適量的偏亞硫酸氫鉀(一種抗氧化劑)。將所得的果汁離心并過濾以得到澄清的果汁。

    測量項目和方法:

    ×每種果實的平均重量(n=50)

    ×得到的果汁率(%)

    ×pH

    ×酸度(g/l,以蘋果酸汁)

    ×白利糖度(Brix)

    ×總酚(ppm,以綠原酸汁)

    ×總抗壞血酸

    ×有機酸分析

    ×糖類分析

    ×金屬離子分析×游離氨基酸分析表1中列出了測量結果。

    ??????????????????????表1各種果實的平均重量????(g)得到的果汁率????(%)????pH????酸度(g/l,以蘋果酸計)白利糖度總酚(ppm,以綠原酸計)總抗壞血酸(ppm)成熟“富士”果汁????287.2????66.1????3.88????2.73????11.6????720????—??未成熟“富士”果汁????5.1????51.0????3.78????6.83????5.2????6,200????254?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????金屬離子????(ppm)????K????Ca????Mg????Fe????Na成熟“富士”果汁????1,430????15????16????0????9未成熟“富士”果汁????3,050????250????130????13????28?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????有機酸(%)????糖類(%)????蘋果酸???奎尼酸????(總量)????葡萄糖???果糖????蔗糖山梨糖醇(總量)成熟“富士”果汁????0.39???0.02????(0.41)????2.12????6.72????2.52????0.31(11.67)未成熟“富士”果汁????0.49???1.17????(1.65)????0.70????0.49????0.03????0.44(1.66)???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????游離氨基酸ASP?THR?SER????ASN?GLU?GLN?GLYALACIT?VALMET?ILEU?LFU?TYR?PHE?α-ABAγ-ABAMEA?HYLYS?IM-BIS?BISLISARG成熟“富士”果汁211?2?10???207??29?243?2?7????3未成熟“富士”果汁32?40?42???3,280?13?36?524?378?25?52?76?114????33744????9????14????1947??34

    從表1中可以清楚地看出,未成熟蘋果汁和成熟蘋果汁之間在組成上有很大不同。在未成熟蘋果汁中,特別是總酚、總抗壞血酸、有機酸(特別是奎尼酸)、金屬離子和游離氨基酸(尤其是天冬酰胺、苯丙氨酸和γ-氨基丁酸)很豐富。同時,在未成熟蘋果汁中,糖幾乎沒有。

    接著,使未成熟蘋果中所含的多酚經HPLC進行組分分析。

    作為多酚樣品,使用了使未成熟蘋果提取物經固相提取(見實施例2)而得到的純化多酚。

    圖1列出了分析結果。

    從圖1中可以清楚地看出,未成熟蘋果中所含的樣品多酚絕大多數由咖啡酸衍生物(綠原酸等)、對香豆酸衍生物、黃烷-3-醇類(兒茶素、表兒茶素等)、黃酮醇類(五羥黃酮苷類)和二氫查耳酮類(根皮素苷類,特別是根皮苷)組成。其中大量含有綠原酸、兒茶素、表兒茶素和根皮苷。實施例2未成熟果實中多酚的抗氧化活性起始材料:用下列起始材料。

    成熟的蘋果:不用袋子生長的市售產品

    未成熟蘋果:在六月中旬采集的。

    “富士”:平均重量=4.97g(n=50)

    “Tugaru”:平均重量=7.80g(n=50)

    “Jonagold”:平均重量=3.86g(n=50)

    “Hokuto”:平均重量=3.32g(n=50)

    “Ohrin”:平均重量=10.34g(n=50)

    未成熟的梨:在六月初采集的

    “Hohsui”:平均重量=8.98g(n=50)

    未成熟的桃:在六月初采集的

    “Akatuki”:平均重量=5.03g(n=50)樣品的制備

    果汁樣品:重復實施例1中的方法以得到澄清的果汁。

    提取物樣品:通過將400g起始材料與含1%HCl的甲醇一起勻漿,

    ????????????然后將所得的材料在回流條件下進行提取(三次),

    ????????????減壓濃縮提取物以除去甲醇,向其中加入氯仿以進

    ????????????行分配(兩次),回收水層,過濾水層,然后將蒸

    ????????????餾水加至濾液中,以達到200ml的總體積。

    按需要,使果汁樣品和提取物樣品用Seppack?C18進行固相提取,以得到多酚部分。抗氧化活性的檢驗方法

    使用下列抗氧化活性的檢驗方法。

    在一緊緊塞好的試管中,將5ml堿溶液(含4%亞油酸的乙醇)與4ml磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)和1ml樣品溶液混合。在光屏蔽下,將試管保持于50℃恒溫箱中。在相同條件下,也放置一含用乙醇代替亞油酸的試管(對照樣)和含樣品溶劑代替樣品的試管(空白樣)。

    在貯存期間,隨時間的流逝采集反應混合物的樣品,以便用異硫氰酸鹽方法(硫氰酸鐵法)定量地測定所形成的過氧化物的量。

    檢測結果

    檢測未成熟富士蘋果提取物和成熟富士蘋果提取物的抗氧化活性。

    將上述兩種提取物以1-1,000μl/g(亞油酸)的濃度分別加到反應系統中。加入一星期后,測量形成的過氧化類脂的量(在500nm處的吸收度)。圖2中列出了其與加入的提取物濃度的關系。

    如圖2所示,在未成熟的“富士”提取物和成熟的“富士”提取物中均可見到對亞油酸的抗氧化活性,但在未成熟“富士”提取物中,該活性更高。

    接著,為了研究哪些物質具有抗氧化活性用Sep-pack?C18將未成熟的“富士”提取物和成熟的“富士”提取物分別大致分成兩部分,即部分A(非吸附的部分)和部分B(吸附的部分,多酚部分)。以1-1,000μl/g(亞油酸)的濃度,將提取物、部分A和部分B各自獨立地加到反應系統中。加入一星期后,測量所形成的過氧化類脂的量(在500nm處的吸收度)。圖3中列出了它與提取物或部分A或B的量的關系。

    從圖3中可以清楚地看出,成熟“富士”蘋果提取物的抗氧化活性是以提取物的部分B為基礎的。在未成熟“富士”蘋果的提取物中,部分A和部分B均具有抗氧化活性,但部分B的活性更高。

    上述情況表明,成熟和未成熟“富士”蘋果提取物的抗氧化活性主要取決于存在于部分B中的化合物,即存在于部分B中的多酚化合物。

    在蘋果中所含的簡單多酚化合物中,測量了市售的那些化合物的抗氧化活性。以0.2μM/g(亞油酸)的濃度將每種上述化合物加到反應系統中。加入一星期后,測量所形成的過氧化類脂的量(在500nm處的吸收度)。圖4列出了各種多酚化合物加入一個星期后的吸收度。

    圖4中,除上述多酚外,還包括對比物質,即三種已知的抗氧化劑(BHA、BHT和維生素E)以及存在于上述部分A中的典型化合物(奎尼酸、蘋果酸和γ-氨基丁酸(GABA)]。

    結果,在所述多酚化合物中,六種化合物(咖啡酸、綠原酸、(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、五羥黃酮和蕓香苷(五羥黃酮-3-rha)]具有與BHA和BHT相同的抗氧化活性。然而,象對香豆酸、根皮素和根皮苷這類多酚沒有抗氧化活性。此外,存在于部分A中的化合物不具有任何抗氧化活性。

    通過(1)蘋果中存在的所述化合物的量和(2)其抗氧化活性之間的比較,可以判斷,未成熟蘋果提取物和未成熟蘋果汁所表現出的高抗氧化活性主要來源于綠原酸、(+)-兒茶素和(-)-表兒茶素。

    通過上述可證實,未成熟“富士”蘋果具有高抗氧化活性。此外,鑒定了表現所述活性,且存在于未成熟“富士”蘋果中的化合物。

    繼而,還研究了除未成熟“富士”外的未成熟蘋果是否具有相同的抗氧化活性。

    從各種未成熟蘋果(富士、Tugaru、Jonagold、Hokuto和Ohrin)的提取物分別制備部分B(多酚部分)。以1-500μl/g(亞油酸)的濃度將各部分加到反應系統中。加入一星期后,測量所形成的過氧化類脂的量(在500nm處的吸收度)。圖5中列出了它與所加入部分的濃度的關系。圖5中,也包括未成熟“富士”的結果以進行比較。

    結果,每種蘋果均表現出高抗氧化活性,并且在蘋果種類之間在抗氧化活性方面基本上沒有差別。

    此外,還研究了除未成熟蘋果外的其它未成熟果實的抗氧化活性。

    從各種未成熟果實(富士蘋果,Hohsui梨和Akatuki桃)的提取物分別制備部分B(多酚部分)。以1-500μl/g(亞油酸)的濃度將各部分加到反應系統中。加入一星期后,測量所形成的過氧化類脂的量(在500nm處的吸收度)。圖6中列出了它與所加入部分的濃度的關系。

    結果,未成熟桃具有與未成熟蘋果大約相同的抗氧化活性,而未成熟梨具有相當高的抗氧化活性,盡管該活性低于未成熟蘋果的活性。實施例3存在于未成熟果實中的多酚的ACE(血管緊張肽轉化酶I)抑制活性

    起始材料:使用下列起始材料。

    未成熟蘋果:與實施例2中所用的相同。

    樣品的制備:用與實施例2中相同的方法制備“提取樣品”和“多

    ???????????酚部分”。ACE抑制活性的檢驗方法

    用常規方法進行ACE抑制活性的檢驗。

    將樣品溶液加到市售的ACE溶液中以進行預培養;然后,加入Bz-Gly-His-Leu作為底物以引起反應;用鄰苯二醛標記由該反應形成的His片段;然后測量所得溶液的熒光強度(Ex.360nm,Em.490nm)。

    用下列公式表達樣品溶液的ACE抑制活性:

    {1-(S-SB)/(C-CB)}×100(%)

    其中S:檢驗溶液的熒光強度,

    ????C:對比溶液的熒光強度,其中用水代替樣品,

    ????SB:S空白樣的熒光強度(空白樣含有代替酶的水),和CB:C空白樣的熒光強度(空白樣含有代替酶的水)。檢測結果

    用Sep-pak?C18將未成熟“富士”蘋果提取物和成熟“富士”蘋果提取物分別分成未吸附的部分(部分A)和多酚部分(部分B),測量每部分的ACE抑制活性。圖7中列出了結果。

    結果,在未成熟和成熟蘋果中,部分B均表示出高的ACE抑制活性。特別是,未成熟蘋果的部分B表現出100%的抑制作用。為了更詳細地比較未成熟和成熟蘋果的部分B的ACE抑制活性,在改變加到上述反應系統中的每種部分B的量時,檢測兩種部分B的ACE抑制活性的改變。結果列于圖8。

    結果,成熟蘋果部分B的表現50%抑制作用的濃度,即IC50為約3μl。相反,未成熟蘋果部分B的IC50為0.1μl或更低。因此,未成熟蘋果的部分B表現出很高的ACE抑制活性。

    在除富士的各種蘋果中也觀察到了未成熟蘋果的高ACE抑制活性。

    如上述所看到的那樣,未成熟蘋果含有具高ACE抑制活性的化合物,而該化合物是多酚。隨便提一句,未成熟梨和未成熟桃的ACE抑制活性比未成熟蘋果的低。

    接著,測量存在于未成熟蘋果中并且作為純產品容易得到的各種簡單多酚的ACE抑制活性,具體地說,以各種濃度將各多酚加到反應系統中,然后檢測所述多酚的ACE改善活性的改變。結果列于圖9。

    圖9包括茶兒茶素類(已知茶兒茶素類具有ACE抑制活性)的ACE抑制活性以用于比較。圖9中,(-)-棓酸表棓兒茶素(EGCg)和(-)-棓酸表兒茶素(ECg)的IC50值分別為0.3mM和2mM,且它們有高的ACE抑制活性。據報道,GABALONG茶(日本茶商用的一個商標名),其中,通過加工提高GABA濃度,在使用SHRs(自發性的高血壓大鼠)的試驗中表現出降血壓活性,但在本試驗中,GABA沒有表現出ACE抑制活性。

    同時,存在于未成熟蘋果中的多酚在高濃度時,表現出ACE抑制活性。但其IC50值很低,并且甚至對于表現出最高活性的五羥黃酮,IC50也只有約5mM那樣低。因此,未成熟蘋果多酚表現出遠低于EGCg和ECg的ACE抑制活性。

    因此,以存在于未成熟蘋果部分B中的所有多酚均為EGCg這一假設為基礎,用EGCg的校準曲線計算存在于部分B中的總多酚量。該量約為15,000ppm,計算出部分B中的多酚濃度以EGCg計為33.82mM。用該計算值,在圖9中描制出部分B的活性曲線,該曲線表明部分B具有比EGCg高的ACE抑制活性(IC50=0.2mM)。實際上,部分B既不含EGCg也不含ECg,且如上所述,未成熟蘋果中的簡單多酚沒有顯著的ACE抑制活性。圖9中觀察到的未成熟蘋果部分B的高ACE抑制活性被認為是由于部分B中共存有其它未鑒定的多酚。實施例4鑒定存在于未成熟蘋果多酚中的ACE抑制化合物樣品

    用與實施例3中相同的方法得到未成熟“富士”蘋果提取物,然后使該提取物經固相提取以得到多酚部分。用該多酚部分作為下列的樣品。檢驗方法

    將樣品溶液裝入Sephadex?LH-20柱。用蒸餾水洗滌該柱。然后,以先用20-60%甲醇(用HCl酸化),然后用70%丙酮(用HCl酸化)這樣的順序進行洗脫以得到多酚部分。

    使所得的多酚部分分別經HPLC進行組分分析,測量總酚并檢驗ACE抑制活性。按需要也可測量吸收光譜并進行凝膠滲透色譜(gelpermeation?chromato?graphy)。檢驗結果

    用Sephadex?LH-20柱進行分級分離,以便分離其它多酚樣品中具有ACE抑制作用的化合物。使由洗脫得到的各部分經HPLC進行簡單多酚的組分分析及ACE抑制試驗。若60%甲醇作為洗脫液通過該柱時,可洗脫所有的簡單多酚。同時,所有的具有ACE抑制作用的化合物均在下一種洗脫液,即70%丙酮中。

    將上面得到的具有ACE抑制作用的化合物進行蒸餾以除去溶劑。將剩余物冷凍干燥以得到粉末狀的具有ACE抑制作用的化合物。所述化合物易溶于水(溶液為橙色)且100ml多酚部分(部分B)的產量為約0.7g。

    將上述粉末溶解于水中,并用分光光度計測量溶液的吸收光譜。結果示于圖10。

    所得光譜在280nm處具有最大的吸收度,且形狀與(+)-兒茶素或(-)-表兒茶素的相似。將上述溶液在120℃高壓滅菌處理10分鐘。處理過程中,溶液變紅,認為花色素已形成。這些結果有力地說明上述具有ACE抑制作用的化合物是已知為縮合鞣質的原花青素類(procyanidins)(兒茶素類的規則聚合物)。從Sephadex?LH-20柱的洗脫情況和HPLC的洗脫情況看,估計所述化合物不是二聚物之類(如原花青素B2)的聚合物而是更高的聚合物。

    因此,用GPC測量具ACE抑制作用的化合物的分子量。一般認為用GFC(凝膠過濾色譜法)在含水系統(在含水系統中GFC通常用于蛋白質等)中測量多酚化合物的分子量很困難,因為多酚化合物以疏水鍵或氫鍵的形式,與柱中的填料有很強的親和力。因此,用吡啶/乙酐將每個具有ACE抑制作用的化合物中的酚羥基乙酰化以便使每個所得物質溶于有機溶劑中,并在有機溶劑(THF)中,使所得物質進行GPC分析。結果示于圖11。

    在圖11中,色譜上有一個單寬的峰。通過使用聚苯乙烯同時制備的分子量校準曲線,計算出具有ACE抑制作用的化合物的平均分子量為約2,000。

    還鑒于本文沒有解釋的其它試驗的結果(如用甲苯-α-硫醇的部分分解、FAB-MS測量),試驗性地估計出具有ACE抑制作用的化合物的結構式,并示于圖12。

    從上文可以判斷出,所述具有ACE抑制活性的化合物屬于縮合鞣質類。

    測量多酚部分和70%丙酮洗脫液,即使多酚部分經Sephadex?LH-20分級分離得到的縮合鞣質類部分的總酚量,并將兩個量進行比較。結果列于表2。

    表2

    ????????????????總酚量(ppm以兒茶素計)

    ????????????????分級分離前????分級分離后????分級分離前

    ??????????????????????????????????????????????????????(%)

    ????????????????(總多酚)??????(縮合鞣質類)??分級分離后未成熟的蘋果提取物??22,800????????10,800????????47.3成熟的蘋果提取物????1,340????770????57.5

    從表2中清楚地看出,所述縮合鞣質類約占存在于未成熟蘋果中的總多酚的一半,并且是存在于所述多酚中占最大量的組分。

    計算所述縮合鞣質類對ACE的IC50,該值很低(以重量計,約為EGCg的IC50值的1/10或更低)。因此,本發明的具有ACE抑制作用化合物有很高的ACE抑制活性。

    從上述結果判斷出,可以用未成熟蘋果的多酚作為有效的ACE抑制藥劑。實施例5生產未成熟果實的多酚

    用壓碎機將約50Kg的未成熟蘋果(5-10g/蘋果)壓碎,同時加入適量的SO2,然后用油壓機壓榨。將約50ppm的果膠溶解酶加到所得的果汁中,將混合物離心或用硅藻土過濾,并進一步進行精細微過濾以得到35l的澄清果汁。使澄清的果汁通過用苯乙烯-二乙烯基苯型的工業用合成吸附劑樹脂(6l)填充的柱子。然后,使6l含0.1%HCl的水通過該柱以除去糖類。此后,使含0.1%HCl的50%的乙醇通過柱子以得到3l含主要多酚的部分。

    用蒸發器減壓濃縮該部分,以得到1.5l濃縮的部分。用噴霧干燥器干燥濃縮的部分以得到228.2g未成熟蘋果的多酚粉末產物。

    回收率(%)數據如下:

    柱中的回收率:95.6%

    噴霧干燥的回收率:93.0%

    果汁的回收率:0.65%

    果汁多酚的粉末回收率:88.9%實施例6未成熟果實多酚的抗誘變活性

    在該實施例中,用改進的ames方法(Mutation?Research,Vol.31,p.347,1975)測量抗誘變活性。起始材料和樣品的制備

    與實施例2、3和4中所用的相同。下文將實施例4中得到的縮合鞣質類稱為“蘋果鞣酸”。抗誘變活性的檢驗方法

    將抗誘變化合物[苯并(a)芘或Trp-P-2]溶液與磷酸鹽緩沖液、樣品溶液、S9-mix和沙門氏菌(通過過夜培養鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella?typhimurium)TA98或TA100而得到的溶液)混合。將混合物于37℃培養2天。計數所得的菌落數。基于以幾何級數表達的換算法,每種多酚的用量為1和300μg/板。用下列公式計算抗誘變活性:

    抗誘變活性(%)={(C-B)-(S-B)}÷(C-B)×100其中S:檢測溶液的菌落數

    C:對照樣的菌落數,其中用水代替樣品,和

    B:空白樣的菌落數,其中用水代替樣品和誘變化合物。結果

    圖13和圖14中,分別列出了各種多酚和蘋果鞣酸對Trp-P-2和苯并[a]芘的抗誘變活性。在圖13和圖14中,縱坐標軸表示抗誘變活性(%),以與空白樣所表現的相同的抗誘變性為100%。橫坐標軸表示每板的樣品量。

    結果,蘋果鞣酸抑制各誘變劑的誘變性依賴于蘋果鞣酸的誘變性,且該抑制效果等于或高于棓酸表棓兒茶素的抑制效果。在本實施例的試驗中,約17μg(約合51μg棓酸表棓兒茶素)的蘋果鞣酸對1μgTrp-P-2,約37μg(約合56μg棓酸表棓兒茶素)的蘋果鞣酸對5μg苯并[a]芘均表現出50%的抗誘變活性。即,蘋果鞣酸含有大量強烈抑制誘變劑(致癌劑)的誘變性的化合物。因此,本發明所得到的水果多酚也是一種很有效的抗誘變藥劑。實施例7存在于未成熟果實中的多酚的透明質酸酶抑制活性

    在本實施例中,測量了透明質酸酶抑制活性,以用其作為抗變態反應活性的指示劑。起始材料和樣品的制備

    與實施例6中所用的相同。透明質酸酶抑制活性的檢驗方法

    以改進的J.Biol.,Vol.250,p.79,1975中描述的方法為基礎,進行透明質酸酶抑制活性的測量。即,將樣品溶液加到市售的透明質酸酶溶液中,并進行預培養。向其中加入一種化合物48/80(組胺釋放劑(histamine?releasant))溶液,在37℃將透明質酸酶活化。然后加入透明質酸溶液作為底物,并進行反應。

    使由上述反應產生的N-乙酰基葡糖胺經Elson-Morgan方法顯色。在586nm處測量該顏色的吸收度。用下列公式計算透明質酸酶抑制活性(%):

    透明質酸酶抑制活性(%)={(C-CB)-(S-SB)}÷(C-CB)×100其中S:檢測溶液的吸收度

    C:對照樣的吸收度,其中用緩沖液代替樣品

    SB:S空白樣的吸收度(空白樣不含酶),和

    CB:C空白樣的吸收度(空白樣既不含樣品也不含酶)。結果

    圖15列出了各種水果提取物的透明質酸酶抑制活性,圖16列出了色甘酸鈉和蘋果鞣酸的透明質酸酶抑制活性。

    結果,各種水果提取物和蘋果鞣酸均表現出其濃度依賴性的透明質酸酶抑制活性。圖16中,列出了色甘酸鈉的透明質酸酶抑制活性作為對比。色甘酸鈉的IC50(表現出50%抑制作用的濃度)約為0.051mg/ml,而蘋果鞣酸的IC50為約0.086mg/ml并與色甘酸鈉的IC50相近。

    因此,該多酚(蘋果鞣酸)含有大量抑制透明質酸酶(與I型變態反應有關的酶)活性的化合物。因此,本發明所得到的水果多酚也是一種非常有效的抗變態反應藥劑。實施例8存在于未成熟水果中的多酚的葡萄糖基轉移酶抑制活性

    在本實施例中研究了水果多酚對GTase[該酶由蔗糖產生不可溶的葡聚糖,且是由S.sobrinus(一種典型的防齲菌)產生的]的抑制活性。起始材料和樣品的制備

    與實施例6和7中所用的相同。所用的細菌:Streptococcus?sobrinus?ATCC?33478GTase的制備

    按如下制備S.sobrinus的GTase。

    將S.sobrinus在TTY培養基[Agric.Biol.Chem.,54(11),PP.2925-2929,1990]中于37℃培養18小時。進行離心以除去細菌細胞并得到上層清液。向該上層清液中加入硫酸銨至50%飽和。然后,進行離心以回收所得的沉淀。將沉淀再溶于0.05M磷酸鹽緩沖液(pH6.5)中。用相同的緩沖液將所得溶液滲析。滲析液中的GTase用羥磷灰石色譜法純化并分離。用約0.4M磷酸鹽緩沖液洗脫該GTase(能形成不可溶的葡聚糖)。用含GTase的洗脫液進行下列試驗。檢驗GTase抑制活性的方法

    將純化的GTase溶液和樣品溶液加到1ml底物溶液(含2%蔗糖、0.1%疊氮化鈉和40μM葡聚糖T10的0.1M磷酸鹽緩沖液)中。加水稀釋以達到2ml的總體積。使所得溶液在37℃反應18小時。按在550nm處的吸收度所表達的濁度,測量由該反應形成的不可溶葡聚糖的量,并用下列公式計算不可溶葡聚糖的形成率(%)。

    不可溶葡聚糖的形成率(%)=(SS-SB)÷(CS-CB)×100其中SS:樣品的吸收度

    SB:樣品空白樣的吸收度(該空白樣不含酶),

    CS:對照樣的吸收度(不含樣品),和

    CB:對照樣的空白樣的吸收度(該空白樣不含樣品且不含酶)。結果

    圖17列出了各水果提取物的多酚部分的GTase抑制活性,圖18列出了各多酚化合物的GTase抑制活性。在圖17和18中,縱坐標軸表示不可溶葡聚糖的形成率(%),認為對照樣(不含樣品)的形成率(%)為100%。橫坐標軸表示加到反應系統中的樣品或多酚的量(體積或濃度)。

    如圖17所示,各種水果提取物的多酚部分,特別是未成熟“富士”蘋果和未成熟“Niitaka”梨的多酚部分表現出顯著的GTase抑制活性。成熟“富士”蘋果對GTase的IC50為約50μl,而未成熟“富士”蘋果對GTase的IC50為約0.7μl。因此,未成熟蘋果具有比成熟蘋果高約70倍的GTase抑制活性。

    接著研究包括蘋果中所存在的各種多酚化合物的GTase抑制活性。如圖18所示,在蘋果中所存在的多酚化合物中,綠原酸和根皮苷各自具有很低的GTase抑制活性。同時,兒茶素類,表兒茶素單體具有很低的GTase抑制活性,但由估計的圖12的結構式所代表的高分子表兒茶素聚合物(表明為圖18中的蘋果鞣酸)有高的GTase抑制活性。圖18中也列出了棓酸表兒茶素(一種綠茶中所存在的典型的兒茶素并已知為一種GTase抑制物質)[Agric.Biol.Chem.,5(11),pp.2925-2929,1990;Chem.Pharm,Bull.,38(39),pp,717-720,1990]的結果。用圖18所作的計算,棓酸表兒茶素對GTase的IC50為約200ppm,而蘋果鞣酸對GTase的IC50為約2ppm。因此,蘋果鞣酸有比棓酸表兒茶素高約100倍的GTase抑制活性。從這些結果,認為圖17中所看到的未成熟“富士”蘋果的高GTase抑制活性是歸因于蘋果鞣酸的存在。

    因此,本發明所得到的水果多酚含有高GTase抑制活性的化合物,因而也是一種很有效的防齲藥劑。

關 鍵 詞:
水果 及其 生產 方法 用途
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
關于本文
本文標題:水果多酚及其生產方法以及其用途.pdf
鏈接地址:http://www.pqsozv.live/p-319334.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
钻石光影