• / 11
  • 下載費用:30 金幣  

一種蠟狀芽孢桿菌及其應用.pdf

關 鍵 詞:
一種 芽孢 桿菌 及其 應用
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
摘要
申請專利號:

CN201310737546.0

申請日:

2013.12.27

公開號:

CN103667158A

公開日:

2014.03.26

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 專利權的轉移IPC(主分類):C12N 1/20登記生效日:20160226變更事項:專利權人變更前權利人:中國熱帶農業科學院香料飲料研究所變更后權利人:海南興科熱帶作物工程技術有限公司變更事項:地址變更前權利人:571533 海南省萬寧市興隆鎮香料飲料研究所變更后權利人:571500 海南省萬寧市興隆熱帶植物園|||著錄事項變更IPC(主分類):C12N 1/20變更事項:發明人變更前:王輝 趙青云 趙秋芳 王華 莊輝發 宋應輝 朱自慧變更后:趙青云 王輝 趙秋芳 王華 莊輝發 宋應輝 朱自慧|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 1/20申請日:20131227|||公開
IPC分類號: C12N1/20; A01N63/00; A01P3/00; C05F15/00; C05F17/00; C12R1/085(2006.01)N 主分類號: C12N1/20
申請人: 中國熱帶農業科學院香料飲料研究所
發明人: 王輝; 趙青云; 趙秋芳; 王華; 莊輝發; 宋應輝; 朱自慧
地址: 571533 海南省萬寧市興隆鎮香料飲料研究所
優先權:
專利代理機構: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227 代理人: 趙青朵;馮瓊
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201310737546.0

授權公告號:

||||||||||||

法律狀態公告日:

2016.03.16|||2015.09.09|||2015.08.19|||2014.04.23|||2014.03.26

法律狀態類型:

專利申請權、專利權的轉移|||著錄事項變更|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及微生物領域,具體公開了一種蠟狀芽孢桿菌。本發明所述蠟狀芽孢桿菌保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCC?No.7979。本發明所述蠟狀芽孢桿菌可以穩定定殖在土壤中,改善土壤微生物環境,消除連作生物障礙,并對尖孢鐮刀菌具有明顯抑制作用,而且可促進香草蘭的生長,可應用于防治尖孢鐮刀菌和促進香草蘭生長中以及相關產品的制備中。

權利要求書

權利要求書
1.  一種蠟狀芽孢桿菌,保藏編號為CGMCC No.7979。

2.  根據權利要求1所述蠟狀芽孢桿菌,其特征在于,16S rDNA如SEQ ID NO:1所示。

3.  權利要求1所述蠟狀芽孢桿菌在防治尖孢鐮刀菌中的應用。

4.  權利要求1所述蠟狀芽孢桿菌在制備防治尖孢鐮刀菌的產品中的應用。

5.  根據權利要求4所述應用,其特征在于,所述產品為生防制劑或微生物肥料。

6.  一種生防制劑,其特征在于,包括保藏編號為CGMCC No.7979的蠟狀芽孢桿菌以及生防制劑上可接受的助劑。

7.  一種生防制劑的制備方法,其特征在于,將保藏編號為CGMCC No.7979的蠟狀芽孢桿菌接種于pH值為6-8的NA液體培養基中振蕩培養,離心菌體,用無菌水重懸,再離心,用等體積的無菌水懸浮后添加生防制劑可接受的助劑即得。

8.  一種微生物肥料,其特征在于,由保藏編號為CGMCC No.7979的蠟狀芽孢桿菌以及牲畜家禽糞便經固體發酵獲得。

9.  一種微生物肥料的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:
步驟1、將保藏編號為CGMCC No.7979的蠟狀芽孢桿菌接種于pH值為6-8的NA液體培養基中振蕩培養,離心菌體,用無菌水重懸,再離心,用等體積的無菌水懸浮后獲得菌懸液;
步驟2、將菌懸液接種到牲畜家禽糞便中進行固體發酵至所述蠟狀芽孢桿菌數量達到108cfu/g以上,期間固體發酵溫度不高于50℃,獲得微生物菌肥。

10.  根據權利要求9所述制備方法,其特征在于,還包括步驟3:
將所述微生物菌肥進行后熟3-5天,最后在溫度45℃-60℃將其含水量蒸發至30%以下。

說明書

說明書一種蠟狀芽孢桿菌及其應用
技術領域
本發明涉及微生物領域,更具體的說是涉及一種蠟狀芽孢桿菌及其應用。
背景技術
香草蘭(Vanilla planifolia Andrews)是蘭科熱帶藤本香料植物,有“天然食品香料之王”的美譽。其鮮豆莢經過生香加工后含有250多種芳香成分,香氣獨特,被廣泛用于調制各種高級香煙、名酒、茶葉,是各類高檔食品和飲料的配香原料,在國際市場上供不應求。
香草蘭為多年生作物,隨著種植年限的增加,土壤微生物區系失調,土傳病原菌根莖腐病致病菌-尖孢鐮刀菌的數量明顯增加,土壤微生物多樣性趨于簡單,香草蘭長勢弱,出現連作生物障礙問題,嚴重制約了香草蘭種植業的可持續發展。為降低病原菌數量,生產中大量使用農藥,導致生產成本增加、農民負擔加重,豆莢品質下降,生態環境嚴重污染。目前,投產期香草蘭種植園土傳致病菌增加,有益細菌減少,土壤微生物區系失衡已經成為制約香草蘭規模化種植的主要因素,也是亟待解決的關鍵問題。
發明內容
有鑒于此,本發明的目的在于提供一種蠟狀芽孢桿菌,使得該菌株對尖孢鐮刀菌具有明顯抑制作用,且能夠在土壤中穩定定殖。
此外,本發明的另一個發明目的是所述蠟狀芽孢桿菌微生物肥料能夠促進香草蘭的生長。
為實現上述目的,本發明提供一種從20年園齡香草蘭種植園中長勢較好的根際土壤中分離得到的菌株,命名為菌株F-6,篩選分離方法如下:
選擇20年園齡香草蘭種植園中長勢較好的根際土壤,樣品帶回實驗室稀釋涂布、培養。挑選在血瓊脂培養基上有明顯溶血圈的菌株(表明其可產生抗真菌脂肽類活性物質),再通過平板對峙試驗復篩出對香草蘭根莖腐病致病菌-尖孢鐮刀菌有顯著抑制作用的菌株F-6。通過16S rDNA方法(其16S  rDNA如SEQ ID NO:1所示)鑒定菌種為蠟狀芽孢桿菌。菌株F-6可產生抗真菌脂肽類物質,在以麥芽糖、蛋白胨為唯一碳、氮源的條件下生長良好。
本發明所述蠟狀芽孢桿菌已于2013年8月3日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號,中國科學院微生物研究所,保藏編號為CGMCC No.7979。
本發明所述蠟狀芽孢桿菌能夠顯著抑制尖孢鐮刀菌,同時,以107cfu/g數量施用本發明所述蠟狀芽孢桿菌4個月后,其在土壤中的數量仍保持在105cfu/g以上,充分表明本發明所述蠟狀芽孢桿菌可以穩定定殖在土壤中,改善土壤微生物環境,消除連作生物障礙。
因此,本發明還提供所述蠟狀芽孢桿菌在防治尖孢鐮刀菌中的應用以及在制備防治尖孢鐮刀菌的產品中的應用,其中,所述產品優選為生防制劑或微生物肥料。
此外,本發明還提供了一種生防制劑及其制備方法,以及一種微生物肥料及其制備方法。
當本發明所述蠟狀芽孢桿菌應用到生防制劑的制備中時,所述生防制劑包括保藏編號為CGMCC No.7979的蠟狀芽孢桿菌以及生防制劑上可接受的助劑。所述生防制劑上可接受的助劑可以為本領域常用的物質,如載體油、增活劑以及紫外保護劑等。
所述生防制劑的制備方法為,將保藏編號為CGMCC No.7979的蠟狀芽孢桿菌接種于pH值為6-8的NA液體培養基中振蕩培養,離心菌體,用無菌水重懸,再離心,用等體積的無菌水懸浮后添加生防制劑可接受的助劑即得。其中,作為優選,所述培養條件為28℃-35℃,振蕩速度為160-220轉/min,培養時間為24h-48h,最優選為36h。作為優選,所述NA液體培養基配方為:牛肉膏5g/L,蛋白胨10g/L,氯化鈉5g/L,余量為水。所述生防制劑上可接受的助劑可以為本領域常用的物質,如載體油、增活劑以及紫外保護劑等。
當本發明所述蠟狀芽孢桿菌應用到微生物肥料的制備中時,所述微生物肥料,由保藏編號為CGMCC No.7979的蠟狀芽孢桿菌以及牲畜家禽糞便經固體發酵獲得。作為優選,所述牲畜家禽糞便為牛糞、豬糞、羊糞、雞糞、鴨糞、鵝糞或它們的任意種混合物,更優選的,所述牲畜家禽糞便為腐熟后的牛糞、豬糞、羊糞、雞糞、鴨糞、鵝糞或它們的任意種混合物。最優選的, 所述腐熟的各牲畜家禽糞便中,有機質質量比含量≥35%,有機氮質量比含量為1.0%-2.0%,含水量質量比為25%-30%。
所述微生物肥料制備方法包括以下步驟:
步驟1、將保藏編號為CGMCC No.7979的蠟狀芽孢桿菌接種于pH值為6-8的NA液體培養基中振蕩培養,離心菌體,用無菌水重懸,再離心,用等體積的無菌水懸浮后獲得菌懸液;
步驟2、將菌懸液接種到牲畜家禽糞便中進行固體發酵至所述蠟狀芽孢桿菌數量達到108cfu/g以上,期間固體發酵溫度不高于50℃,獲得微生物菌肥。
其中,作為優選,所述培養條件為28℃-35℃,振蕩速度為160-220轉/min,培養時間為24h-48h,最優選為36h。作為優選,所述NA液體培養基配方為:牛肉膏5g/L,蛋白胨10g/L,氯化鈉5g/L,余量為水。
作為優選,所述牲畜家禽糞便為牛糞、豬糞、羊糞、雞糞、鴨糞、鵝糞或它們的任意種混合物,更優選的,所述牲畜家禽糞便為腐熟后的牛糞、豬糞、羊糞、雞糞、鴨糞、鵝糞或它們的任意種混合物。最優選的,所述腐熟的各牲畜家禽糞便中,有機質質量比含量≥35%,有機氮質量比含量為1.0%-2.0%,含水量質量比為25%-30%。
作為優選,所述菌懸液和牲畜家禽糞便的體積質量比為1mL-2mL:10g。
作為所述微生物肥料制備的優選方案,還包括步驟3:
將所述微生物菌肥進行后熟3-5天,最后在溫度45℃-60℃將其含水量蒸發至30%以下。
本發明所述微生物肥料除了能夠明顯抑制尖孢鐮刀菌外,還能夠促進香草蘭的生長,如提高香草蘭根系干重、莖干重、葉片干重、根系直徑、根系總體積等。同時施用含有107cfu/g數量蠟狀芽孢桿菌的微生物肥料4個月后,其在土壤中的數量仍保持在107cfu/g以上,充分表明本發明所述微生物肥料可以穩定定殖在土壤中,改善土壤微生物環境,消除連作生物障礙。
由以上技術方案可知,本發明所述蠟狀芽孢桿菌可以穩定定殖在土壤中,改善土壤微生物環境,消除連作生物障礙,并對尖孢鐮刀菌具有明顯抑制作用,而且可促進香草蘭的生長,可應用于防治尖孢鐮刀菌以及相關產品的制備中。
生物保藏說明
分類命名:蠟狀芽孢桿菌,Bacillus cereus.于2013年8月3日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號,中國科學院微生物研究所,保藏編號為CGMCC No.7979。
附圖說明
圖1所示為不同處理對香草蘭植株地上部及根系干重的影響的柱形圖,每個柱形圖所代表的含義參見圖1圖例,柱形圖上a、b、c、ab、bc、cd字母表示差異顯著程度;
圖2所示為不同處理對香草蘭根系直徑和根系總體積的影響的柱形圖,每個柱形圖所代表的含義參見圖2橫縱坐標標示,柱形圖上a、b、ab字母表示差異顯著程度;
圖3所示為不同處理對香草蘭根際土壤尖孢鐮刀菌數量的影響的柱形圖,每個柱形圖所代表的含義參見圖3橫縱坐標標示,柱形圖上a、b、c字母表示差異顯著程度;
圖4所示為菌株F-6在香草蘭根際土壤定殖情況的柱形圖,每個柱形圖所代表的含義參見圖4橫縱坐標標示,柱形圖上a、b、c字母表示差異顯著程度。
具體實施方式
本發明公開了一種蠟狀芽孢桿菌及其應用,本領域技術人員可以借鑒本文內容,適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是,所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的,它們都被視為包括在本發明。本發明所述蠟狀芽孢桿菌及其應用已經通過較佳實施例進行了描述,相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合,來實現和應用本發明技術。
下面結合實施例,進一步闡述本發明。
實施例1:本發明所述蠟狀芽孢桿菌的分離和鑒定
選擇20年園齡香草蘭種植園中長勢較好的根際土壤,樣品帶回實驗室稀釋涂布、培養。挑選在血瓊脂培養基上有明顯溶血圈的菌株(表明其可產生抗真菌脂肽類活性物質),再通過平板對峙試驗復篩出對香草蘭根莖腐病致病菌-尖孢鐮刀菌有顯著抑制作用的菌株F-6。通過16S rDNA方法鑒定菌種,該菌株F-6屬于蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus),可產生抗真菌脂肽類物質,在以麥芽糖、蛋白胨為唯一碳、氮源的條件下生長良好。菌種于30%甘油中-80℃保存。
所述蠟狀芽孢桿菌已于2013年8月3日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號,中國科學院微生物研究所,保藏編號為CGMCC No.7979。
實施例2:本發明所述生防制劑的制備
將保藏編號為CGMCC No.7979的蠟狀芽孢桿菌接種于pH值為6-8的NA液體培養基中,在28℃-35℃、160-220轉/min轉速下振蕩培養36h,離心菌體,用無菌水重懸,再離心,用等體積的無菌水懸浮后添加載體油、增活劑和紫外保護劑即得。
其中,NA液體培養基配方為:牛肉膏5g/L,蛋白胨10g/L,氯化鈉5g/L,余量為水。
實施例3:本發明所述微生物肥料的制備
將保藏編號為CGMCC No.7979的蠟狀芽孢桿菌接種于pH值為6-8的NA液體培養基中,在28℃-35℃、160-220轉/min轉速下振蕩培養36h,離心菌體,用無菌水重懸,再離心,用等體積的無菌水懸浮后獲得菌懸液;其中,NA液體培養基配方為:牛肉膏5g/L,蛋白胨10g/L,氯化鈉5g/L,余量為水。
將菌懸液接種到腐熟后的牛糞中(菌懸液和腐熟牛糞的體積質量比為2mL:10g)進行固體發酵至所述蠟狀芽孢桿菌數量達到108cfu/g以上,期間固體發酵溫度不高于50℃,每天翻動1次,獲得微生物菌肥。其中,腐熟的牛糞中有機質質量比含量≥35%,有機氮質量比含量為1.0%-2.0%,含水量質量比為25%-30%。
將所得到的微生物菌肥進行后熟4天,最后在溫度45℃-60℃將其含水量蒸發至30%以下。
經過后熟的微生物肥料含有108cfu/g以上的蠟狀芽孢桿菌,總氮磷鉀養分質量比含量為5%-11%,有機質質量比含量為30%-40%。
實施例4:盆栽試驗
采集20年園齡、有明顯連作生物障礙的香草蘭種植園土壤做為供試土壤,試驗盆缽采用周轉箱(內尺寸600×420×165mm),選取長勢一致的健康香草蘭做為供試苗。
將綠色熒光蛋白分子標記后的菌株F-6接種至2000ml含0.3mg/ml卡那霉素的NA液體培養基中,搖床培養36h,離心菌體,用無菌水重懸,再離心,用等體積的無菌水懸浮后獲的菌懸液;其中,NA液體培養基配方為:牛肉膏5g/L,蛋白胨10g/L,氯化鈉5g/L,余量為水。
將菌懸液接種到腐熟后的牛糞中(菌懸液和腐熟牛糞的體積質量比為2mL:10g)進行固體發酵至所述蠟狀芽孢桿菌數量達到108cfu/g,期間固體發酵溫度不高于50℃,每天翻動1次,獲得微生物菌肥。其中,腐熟的牛糞中有機質質量比含量≥35%,有機氮質量比含量為1.0%-2.0%,含水量質量比為25%-30%。
試驗設4個處理:1)對照(CK,施用等量化肥);2)施用牛糞堆肥(OM,施肥量3%);3)施用標記菌株F-6菌懸液(F-6,接種濃度為107cfu/g土);4)施用微生物肥料(BIO,施肥量3%,F-6接種濃度為107cfu/g土)。該盆栽試驗每盆栽種1株香草蘭,每處理重復4次,三次獨立試驗,共48盆。
測定指標:在香草蘭移栽4個月后毀滅性采樣,采用根系掃描儀測定根系形態;植株地上部及根系干重;根際土壤標記菌株F-6及尖孢鐮刀菌數量。結果分別見圖1-圖4。
由圖1可知,施用微生物肥料的處理香草蘭根系干重、葉片干重和莖干重除莖干重和施用牛糞堆肥處理不顯著外,其余均顯著高于其他處理。
由圖2可知,施用微生物肥料的處理根系直徑和根系總體積均高于其他處理,這說明施用微生物肥料可促進香草蘭根系生長。另外,施用牛糞的處 理根系直徑和總體積與對照相比無明顯差異,表明施用牛糞有機肥對改善香草蘭根系生長狀況無顯著效果。
由圖3可知,施用微生物肥料及菌液F-6的處理香草蘭根際土壤尖孢鐮刀菌數量顯著低于對照及施用牛糞的處理,施用微生物肥料的處理尖孢鐮刀菌數量顯著低于施用F-6的處理,另外,對照與施用牛糞的處理之間差異不顯著。表明施用微生物肥料或F-6菌液均可顯著抑制香草蘭根際土壤有害真菌尖孢鐮刀菌的生長,降低其在根際土壤數量。
由圖4可知,施用F-6菌液或其微生物肥料4個月后,F-6在土壤中的濃度分別在105cfu/g及107cfu/g以上,而在對照及施用牛糞堆肥的處理中并未檢測到該菌株,這說明F-6可在土壤中穩定定殖,利于香草蘭生長,改善土壤微生物環境,消除連作生物障礙。并且,施用微生物肥料的處理F-6在根際土壤的數量顯著高于單獨施用菌液的處理,這表明微生物有機肥可為F-6提供豐富的碳、氮源,更利于其在土壤中存活。
以上所述僅是本發明的優選實施方式,應當指出,對于本技術領域的普通技術人員來說,在不脫離本發明原理的前提下,還可以做出若干改進和潤飾,這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。

關于本文
本文標題:一種蠟狀芽孢桿菌及其應用.pdf
鏈接地址:http://www.pqsozv.live/p-6180782.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
钻石光影